Достаточно широко представлено царство грибов. Всего к настоящему моменту для территории ГПЗ «Калужские засеки» идентифицировано 486 видов высших грибов - макромицетов, 431 вида. Аскомицеты (Ascomycota) – 26 видов, Basidiomycota (Базидиомице́ты) - 405 видов достоверно определены и описаны на территории ООПТ.
Также, выявлен 161 вид из 64 родов грибов миксомицетов. Из них из подстилки, ходов и полостей в древесине выделено 134 вида, а с шерсти - 76. Исключительно на шерсти отмечено 26 (16 %) видов. Наиболее разнообразен род Penicillium - 44 вида, далее идут Trichoderma - 11 и Acremonium - 7. Характерны для изученного леса Geomyces pannorum, Penicillium brevicompactum, P. simplicissimum, Trichoderma hamatum и T. harzianum.
Трудно переоценить значение заповедника "Калужские засеки" для сохранения редких и находящихся под угрозой исчезновения видов грибов. В 2015 году вышло в свет второе издание Красной книги Калужской области (Т.1. Растительный мир), один из разделов которой посвящен редким грибам. Из 29 видов, взятых под охрану в регионе - 23 произрастают в заповеднике, где осуществляется наиболее эффективная охрана их местообитаний.
Среди макромицетов (шляпочных) около 200 видов можно употреблять в пищу. Многие грибы заповедника являются лекарственными и успешно используются в медицине как источники веществ для изготовления мазей, настоек и др. препаратов. Например, сухлянка двулетняя (Coltricia perennis) обладает выраженной противоопухолевой активностью, применяется как внутреннее средство против опухолей на ранней стадии. Вытяжка из плодовых тел зеленушки (Tricholoma equestre) подавляет развитие патогенных бактерий. Ее биоактивные вещества способствуют расщеплению фибриногена и рассасыванию кровяных тромбов, в связи с чем возможно их использование при лечении тромбозов. Кроме того, в зеленушке обнаружены вещества, стимулирующие иммунную систему и обладающие противоопухолевой активностью. Опенок зимний (Flammulina velutipes) обладает противораковой, антиоксидантной, антигеронтологической, иммуномодулирующей, антибактериальной активностью. Помимо лекарственных свойств это деликатесный гриб с отличными вкусовыми качествами. Плодовые тела польского гриба (Xerocomus badius) содержат аминокислоту тианин, вещество, которое снижает кровяное давление, подавляет негативное действие кофеина, помогает расслаблению и успокоению, способствует снижению веса. И, наконец, самый известный лекарственный гриб - чага (Inonotus obliquus), который повышает защитные реакции организма, активизирует обмен веществ в мозговой ткани, действует противовоспалительно, антиоксидантно, а также задерживает рост некоторых опухолей. Это далеко не полный перечень лекарственных грибов заповедника "Калужские засеки".
Полидоминантные широколиственные леса заповедника «Калужские засеки» наиболее интересны как место обитания редких видов грибов. В дуплах и на стволах живых дубов, на старых пнях здесь встречается печеночница обыкновенная (Fistulina hepatica Fr.), в августе обильна веселка обыкновенная или Фаллюс нескромный, или Сморчок вонючий, или Сморчок подагрический (лат. Phallus impudicus) – гриб рекордсмен среди растений по скорости роста. Вплоть до снега обильно встречается на деревьях опенок зимний (Flammulina velutipes), который цениться грибниками, так как обладает противораковой, антиоксидантной, антигеронтологической, иммуномодулирующей, антибактериальной активностью. Помимо лекарственных свойств это деликатесный гриб с отличными вкусовыми качествами. И, наконец, самый известный лекарственный гриб - чага (Inonotus obliquus).
Грибы имеют большое значение для поддержания устойчивости природных комплексов заповедника. Они являются микоризообразователями и тем самым способствуют повышению эффективности минерального питания высших растений. Основная функция грибов в природных сообществах - разложение органических веществ в основном растительного происхождения. Они - важнейшие редуценты в любом биогеоценозе.
Изучение микобиоты заповедника не завершено. Новые исследования позволят обнаружить новые виды и получить дополнительную информацию о закономерностях их развития и распространения на территории "Калужских засек".