—————————————————————————————————————
НИИ кардиологии, Томский НИМЦ, Томск, РФ:
О.А.Егунов, С.А.Афанасьев, Д.А.Кондратьева, Э.Ф.Муслимова, И.В.Степанов, А.А.Бощенко
ООО "Айкон Лаб ГмбХ", Нижний Новгород, РФ:
А.С.Гришин, Э.Р.Михеева
—————————————————————————————————————
В исследованиях in vitro и in vivo оценивали эффективность и безопасность в качестве потенциальной противоспаечной перикардиальной заплаты двух типов образцов на основе биосовместимого полимерного материала из олигомеров метакрилового ряда (материал реперен), армированного полиамидной сеткой и без армирования. В in vitro экспериментах при заселении клеточных колоний фибробластов человека на исследуемые образцы адгезии и агрегации не обнаружено. В экспериментах in vivo при имплантации образцов в подкожную клетчатку бедра крыс с последующим выведением животных из эксперимента через 1, 2 и 3 нед имплантируемые образцы легко отделялись от окружающих тканей, слабо фиксируясь только в зоне краёв. При гистологическом исследовании на 2-й неделе после имплантации различия между опытными и контрольной группами не обнаруживались, а на 1-й и 3-й неделях фиброз и воспаление были более выражены у животных контрольной группы (с симуляцией имплантации). Оба образца заплат из материала реперен (с армированием полиамидной сеткой и без армирования) in vivo и in vitro продемонстрировали свойства, позволяющие рассматривать их в качестве потенциальной противоспаечной перикардиальной заплаты для клинического применения.
—————————————————————————————————————
Ключевые слова: сердечно-сосудистая хирургия; врождённые пороки сердца; рестернотомия; кардиология; противоспаечная заплата
—————————————————————————————————————
Основным фактором риска при реоперациях является повторный доступ, технические аспекты и подходы к которому остаются сложной задачей. Выполнение рестернотомии и кардиолиза в рубцово-изменённых тканях сопряжено с колоссальным риском повреждения сердца и магистральных сосудов ввиду отсутствия чётких топографо-анатомических ориентиров [1].
В настоящий момент существуют два основных пути, облегчающих выполнение рестернотомии: использование препаратов или заплат, главная задача которых — снижение образования спаечного процесса или отграничение сердца от грудины [2–4]. К сожалению, существующие препараты — преимущественно экспериментальные образцы, которые не имеют авторитетной доказательной базы и не удовлетворяют всем необходимым требованиям, или же обладают свойствами, ограничивающими их применение в сердечно-сосудистой хирургии [3,5]. Поэтому использование барьерных заплат, фиксирующихся между сердцем и грудиной, в настоящее время является приоритетным и наиболее распространённым способом, облегчающим выполнение рестернотомии [6].
Изделия из реперена — полимера, состоящего из олигомеров метакрилового ряда, более 10 лет применяются для реконструктивно-восстановительных операций в нейро- и абдоминальной хирургии. За этот период материал продемонстрировал высокие свойства инертности к тканям, позволяющие рассматривать его в качестве потенциальной противоспаечной заплаты в кардиохирургии.
Цель данной работы — оценить в исследовании in vitro и in vivo биосовместимость, адгезивные свойства и выраженность фиброза в зоне имплантации заплат на основе материала реперен с армированием полиамидной сеткой и без.
Методика исследования
Объектом исследования являлись два вида заплат. Заплата R5 размером 80 × 80 × 0.25 мм изготавливалась методом фотополимеризации из биосовместимого пространственно-сшитого полимера на основе олигомеров метакрилового ряда (материал реперен). Изготовленная по такой же технологии заплата R4 (80 ×80 × 0.25 мм) была дополнена армирующим слоем из полиамидной сетки, которая со всех сторон была покрыта репереном. Заплаты были произведены российской компанией ООО "Айкон Лаб ГмбХ". На основе данного материала зарегистрировано медицинское изделие "Эндопротезы полимерные для реконструктивно-восстановительной хирургии РЕПЕРЕН® (REPEREN®) по ТУ 9398-003-89868501-2014" (РУ № РЗН 2015/3449 от 05.04.2023 г.), класс потенциального риска изделия 3, область применения — абдоминальная и нейрохирургия.
Исследование одобрено локальным этическим комитетом НИИ кардиологии Томского НИМЦ (Протокол № 258 от 10.01.2024 г.). Все процедуры проводились в испытательной лаборатории в соответствии с ГОСТ 33044-2014 "Принципы надлежащей лабораторной практики", Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета ЕС об охране животных, используемых в научных целях.
Эксперименты in vitro. Фибробласты человека выделяли и культивировали до образования первых клеточных колоний (длительность ~7 сут). Затем изучаемые заплаты (R5 и R4) закрепляли на дне чашки Петри с помощью стерильного стекла. Части ранее полученной клеточной "плёнки" помещали поверх исследуемых заплат. Эксперимент повторяли 3 раза. Через 14 сут после заселения клетками образцы фиксировали метанолом в течение 5 мин для последующего морфологического изучения. После этого заплаты готовили для гистологического исследования: вынимали из чашек Петри, окрашивали гематоксилином и эозином и расправляли на предметное стекло. Исследование проводили с помощью светового микроскопа Axio Imager.M2 (Carl Zeiss) при увеличении 100, 200. Затем образцы заливали в парафиновые блоки и готовили серийные срезы толщиной 1–2 мкм с последующим исследованием на световом микроскопе Axio Imager.M2 при увеличении 200.
Эксперименты in vivo. Образцы заплат имплантировали в левую бедренную мышцу мелких лабораторных животных. Исследование по принципу "случай-контроль" проводили на крысах-самцах Вистар (n=30) массой 220–270 г. Животных содержали в условиях конвенционального вивария. Рандомизация осуществлялась методом запечатанных непрозрачных конвертов, количество которых соответствовало расчётному размеру выборки (n=30). Перед началом операции у каждого животного вскрывали один конверт, содержащий одно кодовое наименование: контроль, R5 или R4. Таким образом, выборка была разделена на две опытные группы: R5 (n=7), R4 (n=8) и одну контрольную (n=15). Животным, вошедшим в контрольную группу, проводили симуляцию имплантации в левой бедренной мышце.
Имплантацию исследуемых заплат и её симуляцию выполняли под общим наркозом (раствор золетила в дозе 30 мг/кг внутримышечно). В асептических условиях стерильным хирургическими скальпелем рассекали кожу, подкожную жировую клетчатку и формировали карман в левой бедренной мышце вдоль хода её волокон. Длина разреза ~10 мм. В сформированный мышечный карман помещали фрагмент исследуемой заплаты R5 или R4 размером 3 × 3 мм, у контрольных животных мышечный карман оставался пустым. Затем выполнялось послойное ушивание операционной раны стерильным шовным материалом — нитью Пролен 5/0 (Ethicon).
После завершения вмешательства и пробуждения животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде.
Гистологическое и морфологическое исследование. Животных выводили из эксперимента внутривенным введением смертельной дозы золетила (100 мг/кг) через 1, 2 и 3 нед после имплантации. Отделяли мышечный лоскут бедра с имплантированной заплатой (R5 и R4) или без неё (контроль). Выделенный фрагмент помещали в пробирку с забуференным 10 % раствором формалина, после чего проводили подготовку к морфологическому и гистологическому исследованию.
Для оценки микроскопических характеристик исследуемых образцов на ротационном механическом микротоме (HM 355S; Thermo Fisher Scientifi c) с одного блока готовили по два среза толщиной 5–6 мкм, затем окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван Гизону на аппарате Leica ST5010 Autostainer XL. Заключение под покровные стёкла проводили с помощью автомата ClearVue (Thermo Fisher Scientifi c).
Морфологическое исследование проводилось в объёме рутинной световой микроскопии с микрофотографией гистологических препаратов. Выраженность фиброза и воспалительной реакции оценивали полуколичественным методом по 3-балльной шкале на тканевых образцах, окрашенных по Ван Гизону: 1 балл — слабая, 2 балла — умеренная, 3 балла — высокая выраженность реакций.
Статистический анализ. Полученные результаты обрабатывали в программе Statistica 12.0 (StatSoft, Inc.). Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (М±SD). Сравнение средних значений проводили с помощью t критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при p<0.05.
Результаты исследования
В in vitro экспериментах при заселении клеточных колоний фибробластов на поверхности заплат R4 и R5 адгезии и агрегации клеток не наблюдали. Группа фибробластов, обнаруженная в одной серии на заплате R5, не имела выраженной адгезии и была легко удалена при промывании в физиологическом растворе. На боковой поверхности заплат визуализировались единичные клетки, что было обусловлено неровной линией разреза материала (рис. 1, 2).
В in vivo экспериментах в каждой контрольной точке (1, 2 и 3 нед) имплантируемые заплаты легко отделялись от окружающих тканей, слабая фиксация наблюдалась только в зоне краёв, резанных хирургическими ножницами. При визуальной оценке исследуемые заплаты R4 и R5 не различались.
Через 1 нед после имплантации из группы R4 было выведено 3 крысы, из группы R5 — 2 особи, из контрольной — 5 особей. Различий в гистологической картине при окрашивании гематоксилином и эозином и по Ван Гизону не выявлено. В зоне имплантации заплат присутствовал слабо выраженный фиброз и минимальная воспалительная инфильтрация. При сравнении гистологической картины в опытных и контрольной группах явно определялся более выраженный фиброз и воспалительная инфильтрация в последней (таблица).
На 2-й неделе из группы R4 было выведено 3 крысы, из группы R5 — 2 особи, из контрольной — 5 особей. Гистологическая картина в обеих опытных группах после имплантации не различалась. В зоне имплантации присутствовал фиброз и воспалительная инфильтрация разной степени выраженности. Различия в выраженности фиброза и воспалительной инфильтрации между опытными и контрольной группами не выявлялись (таблица).
Через 3 нед после имплантации из эксперимента выводили 5 крыс из контрольной группы и 5 крыс — из опытных (2 особи из группы R4, 3 — из группы R5). Различия в гистологической картине в опытных группах не определялись. В зоне имплантации присутствовал фиброз и воспалительная инфильтрация разной степени выраженности. Более выраженный фиброз и воспалительная инфильтрация наблюдались в контрольной группе (рис. 3; таблица).
Спаечный процесс в перикарде, развивающийся после хирургического лечения как врождённых, так и приобретённых пороков сердца, является причиной осложнений и летальных исходов при повторных вмешательствах. Для снижения рисков, связанных с рестернотомией, широко используются как рассасывающиеся, так и нерассасывающиеся барьерные материалы, облегчающие выполнение и увеличивающие безопасность рестернотомии.
Свойства идеального барьерного материала должны включать низкую выраженность воспаления и иммунной реакции, кроме того, материал должен крепко удерживаться на месте, желательно без швов, сохранять свойства в присутствии крови и быть полностью биодеградируемым. Более того, материал не должен нарушать заживление раны и провоцировать присоединение инфекции [2,7].
Рассасывающиеся противоспаечные заплаты, используемые в детской кардиохирургии, также не лишены недостатков. Главный из них — накопление продуктов деградации заплаты в полости перикарда, являющееся непосредственной причиной констриктивного перикардита, что особенно актуально для маленьких детей [8–10]. Именно поэтому в кардиохирургии нашли применение только заплаты из твёрдых материалов или некоторые виды гелей. Основным ограничением применения гелей является требование контакта с сухой поверхностью, что недостижимо в кардиохирургии. Ещё одним недостатком, характерным для рассасывающихся и нерассасывающихся заплат, является риск присоединения инфекции. Поэтому материалы, используемые в качестве противоспаечных заплат, должны быть максимально инертными для организма в целом и полости перикарда в частности. В достаточно крупном исследовании заплат Repel CV (SyntheMed, Inc.) неоднократно отмечались системные воспалительные реакции [11]. Также описаны случаи констриктивного перикардита, возникшего вследствие воспалительной реакции у пациентов после имплантации одной из самых распространённых в кардиохирургии мембран — ePTFE (PRECLUDE, Gore) [12].
В проведённом нами исследовании обе разновидности заплат на основе реперена в экспериментах in vivo и in vitro продемонстрировали высокую биосовместимость, а отсутствие фиксации к тканям позволяет рассматривать этот материал для исследования и возможного применения в качестве противоспаечной перикардиальной заплаты.
Конфликт интересов. Работа выполнена за счёт средств компании ООО "Айкон Лаб ГмбХ".
Литература
1. Zhang W., Wang R., Sun Z., Zhu X., Zhao Q., Zhang T., Cholewinski A., Yang F.K., Zhao B., Pinnaratip R., Forooshani P.K., Lee B.P. Catechol-functionalized hydrogels: biomimetic design, adhesion mechanism, and biomedical applications // Chem. Soc. Rev. 2020.Vol. 49, N 2. P. 433–464. doi: 10.1039/c9cs00285e
2. Бокерия Л.А., Бокерия О.Л., Сивцев В.С., Новикова С.П., Салохединова Р.Р., Николашина Л.Н., Самсонова Н.Н., Городков А.Ю., Серов Р.А. Экспериментальная оценка биодеградируемых пленочных композиций на основе желатина с колхицином // Бюл. экспер. биол. 2016. Т. 161, № 3. С. 394–398.
3. Fujita M., Policastro G.M., Burdick A., Lam H.T., Ungerleider J.L., Braden R.L., Huang D., Osborn K.G., Omens J.H., Madani M.M., Christman K.L. Preventing post-surgical cardiac adhesions with a catechol-functionalized oxime hydrogel // Nat. Commun. 2021. Vol. 12, N 1. ID 3764. doi: 10.1038/s41467-021-24104-w
4. Balkenende D.W.R., Winkler S.M., Messersmith P.B. Marineinspired polymers in medical adhesion // Eur. Polym. J. 2019. Vol. 116. P. 134–143. doi: 10.1016/j.eurpolymj.2019.03.059
5. Chan M., Brooks H.J., Moratti S.C., Hanton L.R., Cabral J.D. Reducing the oxidation level of dextran aldehyde in a chitosan/dextran-based surgical hydrogel increases biocompatibility and decreases antimicrobial effi cacy // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol. 16, N 6. P. 13 798–13 814. doi: 10.3390/ijms160613798
6. Song L., Li L., He T., Wang N., Yang S., Yang X., Zeng Y., Zhang W., Yang L., Wu Q., Gong C. Peritoneal adhesion prevention with a biodegradable and injectable N,Ocarboxymethyl chitosan-aldehyde hyaluronic acid hydrogel in a rat repeated-injury model // Sci. Rep. 2016. Vol. 6. ID 37600. doi: 10.1038/srep37600
7. Lundorff P., Donnez J., Korell M., Audebert A.J., Block K., diZerega G.S. Clinical evaluation of a viscoelastic gel for reduction of adhesions following gynaecological surgery by laparoscopy in Europe // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20, N 2. P. 514–520. doi: 10.1093/humrep/deh651
8. Lin X., Wang W., Zhang W., Zhang Z., Zhou G., Cao Y., Liu W. Hyaluronic acid coating enhances biocompatibility of nonwoven PGA scaff old and cartilage formation // Tissue Eng. Part C Methods. 2017. Vol. 23, N 2. P. 86–97. doi: 10.1089/ten.TEC.2016.0373
9. Shen Y., Tu T., Yi B., Wang X., Tang H., Liu W., Zhang Y. Electrospun acid-neutralizing fi bers for the amelioration of infl ammatory response // Acta Biomater. 2019. Vol. 97. P. 200–215. doi: 10.1016/j.actbio.2019.08.014
10. Tu T., Shen Y.B., Wang X., Zhang W., Zhou G., Zhang Y., Wang W., Liu W. Tendon ECM modified bioactive electrospun fibers promote MSC tenogenic differentiation and tendon regeneration // Appl. Mater. Today. 2020. Vol. 18. ID 100495. doi: 10.1016/j.apmt.2019.100495
11. Lodge A.J., Wells W.J., Backer C.L., O’Brien J.E.Jr, Austin E.H., Bacha E.A., Yeh T.Jr, Decampli W.M., Lavin P.T., Weinstein S. A novel bioresorbable fi lm reduces postoperative adhesions after infant cardiac surgery // Ann. Thorac. Surg. 2008. Vol. 86, N 2. P. 614–621. doi: 10.1016/j.athoracsur. 2008.04.103
12. Kageyama R., Ueno K., Sunada M., Midorikawa H., Kanno M., Takano T., Satou K. Constrictive pericarditis with intractable ascites after aortic valve replacement; report of a case // Kyobu Geka. 2018. Vol. 71, N 3. P. 218–221.
