Как я уже написала в прошлой статье про постановку ПЦР, температура отжига - это ключевой фактор для этого процесса. Если она подобрана неправильно, может ничего не получиться.
Температура отжига (annealing temperature) - это температура, при которой праймеры садятся на ДНК. И после этого, на следующей стадии удлинения цепи (elongation) начинается наращивание цепи, начиная с места, где сели праймеры. Если праймеры не сядут на ДНК, то наращивать будет нечего.
Температура отжига варьирует в больших пределах, от 40С до 70С. Крайние температуры используются редко, чаще всего подходящая температура отжига от 50С до 65С.
Чтобы понять, какая нужна температура отжига праймеров, надо хорошо представлять, как подбираются эти самые праймеры. Если вы хотите это сделать сами, то вам потребуются выравнивания тех участков, которые вы хотите амплифицировать для тех групп, с которыми вы работаете или близких к ним групп. Естественно, чем дальше эти группы организмов от тех, которые вы хотите изучать, тем больше вероятность, что полученные праймеры вам не подойдут.
Есть много бесплатных программ, которые позволяют сгенерировать последовательности праймеров на основе уже имеющихся выравниваний.
Например, вот онлайн-программа от NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Eurofins:
https://eurofinsgenomics.eu/en/ecom/tools/pcr-primer-design/
Genscript:
https://www.genscript.com/tools/pcr-primers-designer/standard
Также эта функция есть в некоторых программах, созданных для обработки последовательностей и построению выравниваний, например, в Geneious.
В дизайне праймеров обычно рекомендуют следующие вещи:
1. Длина от 18 до 24 нуклеотидов. Если праймеры слишком короткие, то они могут сесть на нецелевой регион. Если они слишком длинные, то им нужна более низкая температура, чтобы сесть на ДНК.
2. Содержание пар G-C должно быть примерно 40-60%, это обеспечивает оптимальную температуру отжига.
3. Температура отжига должна быть 40-70С. При таких температурах Taq-полимераза может работать. Лучше, чтобы температура была 50-60С. Между нуклеотидами G-C - тройные связи, они легче формируются при более низких температурах. Поэтому чем больше таких пар, тем ниже будет температура отжига.
4. Праймеры не должны быть друг другу комплементарны, иначе они будут слипаться. Концы одного праймера также не должны быть комплеметарны друг другу, иначе они будут слипаться (формировать шпильки), и праймер не сядет на ДНК. Чем ниже температура отжига, тем больше шансов, что праймеры слипнутся, даже если они не идеально комплементарны друг другу.
5. У обоих праймеров должны быть близкие температуры отжига, иначе есть вероятность, что только один праймер сядет на ДНК, а другой - нет.
6. Лучше, чтобы пара первых нуклеотидов праймера были G или C. Поскольку у них тройная связь, это обеспечит лучшее сцепление с ДНК.
Все эти правила не являются обязательными. Есть много хороших рабочих праймеров, которые не соблюдают один или больше этих пунктов.
Разумеется температура отжига редко может быть ниже 40С (не знаю, есть ли вообще такие случаи), но может быть 42С или 43С. Обычно считается, что это очень низко и есть высокая вероятность амплификации неспецифичных фрагментов, но есть праймеры, которые нормально работают и так.
Важное правило - это отсутствие шпилек и взаимной комплементарности праймеров. На это надо обязательно проверять. По крайней мере надо уточнить, при какой температуре праймеры слипаются друг с другом или формируют шпильки, она должна быть значительно ниже используемой температуры отжига.
Также иногда критически важна похожая температура отжига обратного и прямого праймеров. Важно чтобы оба были наиболее эффективны при одинаковых условиях.
Правило длины нарушают постоянно, есть много рабочих праймеров, которые короче или длиннее того, что указано выше. К тому же, для более эффективного секвенирования по Сэнгеру, к праймерам могут прикреплять хвосты (M13-tails) (например, Jennings et al. 2019, Wang et al. 2016). Я на своем опыте убедилась, что эти хвосты действительно увеличивают эффективность праймеров.
Однако дизайн праймеров - это обычно довольно трудоемкая и время затратная деятельность. Казалось бы, загрузил выравнивание на сайт, он вам выдал праймеры, учитывая все правила, вы их заказали, и дело сделано. Но это, к сожалению, не так просто. Часто невозможно учесть все правила, вам придется от чего-то отказаться, рискуя тем, что праймер не будет работать. Эффективную температуру отжига надо обязательно проверить, желательно в ПЦР машинке с возможностью ставить градиент. На таких приборах можно поставить реакцию с разными температурами отжига одновременно.
Для постановки ПЦР с градиентом надо взять 3-4 образца, в которых точно есть ДНК, замешать смесь ПЦР для каждого образца для разных температур. То есть для каждого образца взять по несколько ПЦР-пробирок (обычно 8), туда накапать ПЦР микс (см статью про подготовку к ПЦР) и добавить ДНК. Для каждого образца должно быть несколько пробирок с идентичным содержимым. Затем все пробирки поставить в машинку на протокол с градиентом при разных температурах. Например, вы можете задать градиент от 50С до 60С, и ПЦР машинка выдаст вам температуры для каждого ряда. Их надо аккуратно записать. Потом посмотреть, что получиться на геле. И вы можете увидеть, что у вас полоски очень слабые или их вовсе нет. Тогда надо все начинать сначала.
Как ставить ПЦР с градиентом смотрите здесь
Часто бывает так, что вроде праймеры подобраны по всем правилам, но они не работают, и все тут. И не понятно, почему. Честно признаюсь, что пару раз (или даже больше), пыталась подобрать праймеры, но у меня ни разу еще не получалось. К тому же, для этой цели вам уже нужно иметь выравнивание, которое состоит из последовательностей, взятых из групп близких к тем, с которыми вы работаете, а таких может не быть. Что делать тогда?
В большинстве случаев последовательность берут из статьи, где анализировались группы, которые близки к тем, на которые направлено текущее исследование. Например, если я изучаю какой-то род насекомых, то мне лучше всего взять праймеры. которые используются для организмов той же трибы, ну или хотя бы подсемейства или семейства. На уровне отрядов насекомых праймеры могут работать хуже. Например, праймеры, подобранные для одного семейства бабочек, могут не работать для другого семейства, особенно если речь идет о каком-то сильно вариабельном маркере, где много замен на видовом- родовом уровнях. Для клопов, праймеры для бабочек иногда работают хорошо, иногда не работают вовсе. Праймеры для более консервативных маркеров могут работать для разных отрядов. Температура отжига приводится в той же статье, где публикуется последовательность праймеров. И в каждой статье, где используются определенные праймеры, даже если они были сделаны ранее, публикуется температура отжига, которая используется для этого конкретного случая. Но так или иначе, вам все равно следует проверить температуру отжига праймеров с помощью градиента. Опять-таки, у вас может ничего не получиться, от этого никто не застрахован. Но обычно, если праймеры работают и группа в статье близкая к вашей, результат получается приемлемый.
Может возникнуть вопрос, почему просто нельзя взять температуру отжига из статьи, откуда взяты праймеры? Почему надо обязательно проверять ее с помощью градиента? Дело в том, что температура отжига может зависеть от того, насколько праймеры специфичны к данным объектам. Чем ниже специфичность, тем ниже эффективная температура отжига. К тому же, не всегда авторы статьи подходят ответственно к подбору температуры отжига. Они также могут не очень детально записать температуры в методах. Например, авторы могут использовать несколько температур, но при этом в статье напишут одну. Или они могут дать разброс, который они использовали (например, 50С-55С), но при этом не напишут, какая из температур была наиболее эффективной.
И последнее, о чем я хочу упомянуть - это так называемые "универсальные праймеры". Это праймеры, которые работают для разных групп организмов. Самая известная пара праймеров была подобрана для региона, используемого для баркодинга у животных - цитохром оксидаза I (Фолмеровские праймеры) (Folmer et al. 1994). После этого было создано много других универсальных праймеров для разных маркеров. Универсальные праймеры для COI все также используют, но при этом, где можно, предпочитают более специфичные. Например, для клопов-слепняков эти праймеры работают, но гораздо хуже, чем те, которые были подобраны для насекомых. Обычно праймеры, которые сделаны для многих групп, являются вырожденными. Это означает, что в какой-то позиции (одной или более) могут стоят более одного нуклеотида. То есть, по сути, у вас будет не один праймер, а смесь праймеров. Эта смесь может подойти для многих групп, при это эффективность ее будет не очень высока, потому что не все варианты праймеров в этом коктейле смогут сесть на конкретную ДНК. В любом случае, всегда можно попробовать универсальные праймеры, а потом уже на основе полученного продукта уже сделать свои более специфичные праймеры, если будет необходимость.
Праймеры (их еще называют олигонуклеотиды) можно заказать на сайтах следующих компаний в России : Евроген, Синтол, Бигль. Про эти я точно знаю, возможно, есть и другие.
Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrijenhoek R: DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol Mar Biol Biotechnol. 1994, 3: 294-299.
Jennings, W. B., Ruschi, P. A., Ferraro, G., Quijada, C. C., Silva-Malanski, A. C. G., Prosdocimi, F., & Buckup, P. A. (2019). Barcoding the Neotropical freshwater fish fauna using a new pair of universal COI primers with a discussion of primer dimers and M13 primer tails. Genome, 62(2), 77-83.
Wang, M., Zhang, Y., & Bourgoin, T. (2016). Planthopper family Issidae (Insecta: Hemiptera: Fulgoromorpha): linking molecular phylogeny with classification. Molecular Phylogenetics and Evolution, 105, 224-234.
