Филогенетика и изучение биоразнообразия

Для этой статьи я сделала выравнивание из 20 последовательностей. Как делать выравнивания в Geneious я написала в предыдущей статье. Это все один маркер, цитохром оксидаза с субъединица 1, баркодинговый регион. Это все представители одного рода, очень близкие виды. При таком увеличении черным обозначены позиции, где нуклеотиды отличаются. Надо ли что-то с этим делать? На самом деле в зависимости от ваших целей выравнивание можно редактировать по-разному. Давайте посмотрим на выравнивание поближе...

В прошлый раз я рассказала, как работать с контигами в Geneious. Допустим, вы их просмотрели, приняли решение по каждому нуклеотиду. Обрезали, если посчитали нужным. Что дальше? Для анализа надо сделать выравнивание. Оно нужно для того, чтобы сопоставить позиции разных последовательностей друг с другом, и понять, в какой позиции произошли замены. Ниже я привожу ссылки на некоторые видео о том, как работают разные алгоритмы. Однако таких видео в интернете много, они разные по длительности, по освещаемым аспектам, на разных языках...

В прошлых статьях я объяснила, как загружать сырые сиквенсы в Geneious, как проверять их качество и как делать контиги. Ну вот у нас есть контиги, что с ними делать дальше? Я рекомендую поместить их в другую папку. Для этого можно их выделить и воспользоваться выпадающим меню, как на картинке. То есть их можно вырезать или скопировать, а потом также поместить в другую папку, путем опции Paste. Кнопки Ctrl-C, Ctrl-X, Ctrl-V тоже работают. Вот я у меня два контига в папке. Можно нажать на один из них, и посмотреть на него в нижнем окне...

До этого я написала, как загружать сырые последовательности в Geneious, и как проверять их качество. Допустим, последовательности загружены, мы убедились, что это те последовательности, которые нужны. Что делать дальше? ПЦР мы ставим с двумя праймерами, чтобы последовательность прочиталась с двух цепочек ДНК. В идеале, и на секвенирование надо отдавать с двух праймеров, поскольку если у нас есть две последовательности, которые должны быть комплементарными, то легче контролировать результат. Если...

В прошлой статье я написала, как загружать последовательности в Geneious. Что делать с ними дальше? В информации о последовательности есть несколько столбиков. Я рекомендую обращать на них внимание, потому что там может быть полезная информация, и разные столбики могут быть нужны в разных случаях. Сейчас нам интересны только три из них. Первая колонка, на которую стоит обратить внимание - это sequence length, то есть длина сырой последовательности. Как видно, изначально у всех длина разная. Если последовательность получилась очень короткая, скорее всего, что-то пошло не так...

Я приступаю к следующему блоку своего блога - это обработка последовательностей и их анализ. Прежде чем перейти к конкретным шагам, я хочу сделать небольшой дисклеймер о факторах, которые надо учитывать. Дело в том, что работа с последовательностями очень зависит от ваших целей и задач. Они влияют на то, как лучше работать с данными. Второй немаловажный фактор - это опыт конкретного человека, который вас учит. Я самоучка, никогда не проходила курса по молекулярной филогенетике, и училась у разных...

В двух предыдущих статьях я уже разобрала некоторые ошибки при ПЦР: отсутствие полосок, а также грязный контроль и шмеры. Теперь пришло время обсудить оставшиеся проблемы, а именно (1) полоски есть не для всех образцов или для некоторых образцов они бледные (2) двойные полоски. Пример: В верхнем ряду образцы 241, 245, 246, 247, 254, 258 с яркой полоской, 257 - с бледной полоской, 248, 250 и 255 - с отчетливыми несколькими полосками. 242, 252 и 256 - не получились. 251 яркий, но с небольшим шмером, но эта проблема была обсуждена ранее...

До этого я написала про то, что делать, если полосок на геле не видно. Даже если у вас получились полоски на геле, и означает, что получилось выделение и ПЦР идет, все равно результат вас может не устроить. Не устраивает результат обычно в пяти случаях: (1) Полоски есть, но также есть полоса в отрицательном контроле. (2) Есть шмеры. Шмер - это широкая нечеткая полоса. (3) Полоски есть, но бледные. (4) Полоски имеются не у всех образцов. 5) У некоторых образцов есть дополнительные полоски. Давайте...

Я уже написала несколько статей про выделение ДНК, постановку ПЦР, постановку геля-электрофореза и очистку ПЦР-продукта. Тогда я уже упоминала про некоторые ошибки, но решила написать про них отдельно. Первая проблема, особенно у тех, кто только начинает работать с новой группой - это отсутствие полосок на геле после постановки гель-электрофореза для ПЦР-продуктов. Если вы столкнулись с этой проблемой, то ничего страшного. Нужно просто хорошо проанализировать ситуацию, попробовать разные варианты, и в итоге все получится. Поэтому я всегда рекомендую для начала взять 4-7 образцов из материала, который не жалко, и для которого много дублей...

Ранее я написала о том, зачем нужна очистка ПЦР продуктов. Основные способы очистки ПЦР продуктов можно разбить на три вида. 1) Очистка на колонках. Принцип тот же, что и для выделения ДНК. Берем колонку, выливаем туда ДНК, несколько раз промываем. В итоге в пробирке остаются фрагменты ПЦР-продуктов, а все ненужное остается в колонке, которая выкидывается. Вот примеры таких наборов: Евроген https://evrogen.ru/products/isolation/cleanup Qiagen https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/dna-purification/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit Thermo-Fisher: https://www...

В предыдущих статьях я уже написала про то, как выделять ДНК (часть 1 и часть 2), как ставить ПЦР (часть 1 и часть 2) и как ставить гель-электрофорез (часть 1 и часть 2). В отношении этих трех пунктов нет сомнений, зачем они нужны. Что касается очистки ПЦР продуктов - это немного спорный момент. Кто-то считает, что очистка обязательно нужна, кто-то в норме ПЦР продукты не очищает. Надо сказать, что очистка ПЦР продукта - это допонительный этап, который может занимать 1-2 часа, а то и полдня, и стоить это может тоже прилично (зависит от количества образцов и выбранного способа очистки). Давайте разберемся, что это, и нужно ли...

В предыдущей статье я написала для чего нужен гель-электрофорез, и что для этого нужно. Тут я сконцентрируюсь на том, как его ставить. 1) Во-первых, надо растопить агарозу. Для этого в банку помещается порошок агарозы, который заливается буфером TAE или TBE. Стандартно делают гель 1%, то есть 1г агарозы заливается 100мл буфера. Однако, если у вас мелкие фрагменты, которые быстро двигаются в геле, его можно сделать плотнее, 1.5% или 2%. Концентрация может быть даже больше. Плотность геля зависит от ваших задачи...