Ученые Северо-Осетинского госуниверситета (СОГУ) и врачи НИИ им. Н. В. Склифосовского разрабатывают новый метод лечения травм позвоночника.
"Сотрудники лаборатории системного экологического анализа факультета химии, биологии и биотехнологии СОГУ совместно с учеными НИИ им. Н. В. Склифосовского проводят исследования клеток пуповиноплацентарной крови человека. Ученые изучают то, как введение этих клеток в организм может повлиять на процессы регенерации, в том числе у пациентов с контузионными травмами позвоночника", - сказал ректор СОГУ Алан Огоев.
Лаборатория вуза уже завершила доклинический этап исследований. Ученые провели серию опытов на лабораторных животных и дали токсикологическую оценку безопасности использования клеток. Исследователи рассмотрели изменения в параметрах крови. Было установлено, что введение данных клеток в больших концентрациях, кратно превышающих терапевтическую дозировку, не оказывает токсического воздействия на организм.
На основе результатов, полученных учеными вуза, специалисты НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского Москвы проведут клинические исследования эффективности клеточной терапии на пациентах.
Это статья о результатах исследования: "Мононуклеарные клетки пуповинно-плацентарной крови человека: оценка аллергенности и воздействие на иммунный статус в экспериментах на теплокровных", которая вышла в журнале "Медицинская иммунология".
Авторы статьи: Скупневский С.В., Савельев Р.В., Пухаева Е.Г., Морозова Я.В., Радаев С.М., Смирнов В.А., Гринь А.А.
Мононуклеарные клетки пуповинно-плацентарной крови человека: оценка аллергенности и воздействие на иммунный статус в экспериментах на теплокровных
Мононуклеарные клетки пуповинно-плацентарной крови человека широко вошли в современную клиническую медицину после первой успешной трансплантации, осуществленной в 1988 г. [11]. К настоящему времени они применяются в качестве основной или вспомогательной терапии для лечения порядка 80 различных нозологий, включая онкологические заболевания, анемии, наследственные болезни обмена веществ, иммунодефицитные состояния [16]. Так, один из наиболее перспективных подходов консолидирующего лечения опухолей кроветворной ткани основан на применении гемопоэтических стволовых клеток [2], что позволяет добиться не только репопуляции клеток костного мозга, но и восстановления иммунитета. Согласно результатам статистических исследований, представленных Мировым сообществом по трансплантации крови и костного мозга (The Worldwide Network for Blood and Marrow Transplantation, WBMT), только к 2019 г. осуществлено более 1,5 млн трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток, выделенных из костного мозга, пуповинной крови и из периферической крови после ее афереза [15].
Основными преимуществами МКППКЧ по сравнению с другими источниками являются высокая пролиферативная активность, низкая иммуногенность, возможность подбора редких HLA-типов трансплантатов для этнических меньшинств, возможность увеличения количества стволовых клеток в условиях in vitro, наличие более длинных теломерных участков хромосом, продукция гемопоэтических ростовых факторов [1, 6]. Так, применение МКППКЧ позволяет значительно сократить период ожидания реципиентом подходящего трансплантата, а сама процедура сбора пуповинной крови является безопасной для матери и плода, технически простой, имеет стандартизованный подход к тестированию и типированию по HLA-системе, консервированию и хранению клеточного материала в криобанках [22]. Однако наряду с преимуществами трансплантации стволовых клеток пуповинной крови, существуют недостатки и трудности их использования в медицинской практике.
К ним относятся: потенциальный риск передачи генетических заболеваний; сниженная скорость приживления трансплантата; относительно малое количество гемопоэтических стволовых клеток в единичном заготавливаемом образце; в ряде случаев отсутствие возможности повторного отбора материала; зависимость положительного результата лечения от подбора правильной дозировки клеток [8, 18]. Дальнейшие исследования, посвященные выявлению эффектов МКППКЧ, являются актуальными, поскольку направлены на повышение безопасности клеточной терапии.
Кроме того, непрерывно растущее число публикаций [3, 5, 17, 20], посвященных применению МКППКЧ для лечения негематологических заболеваний, при которых клетки применяются в больших дозах или длительными курсами, заставляет взглянуть на вопросы безопасности применения МКППКЧ с точки зрения классической фармакологии, т. е. рассмотреть их на предмет как острой, так и специфической токсичности.
Цель – изучить аллергенное и иммунотоксическое действие мононуклеарных клеток пуповинно-плацентарной крови человека в экспериментах на теплокровных животных.
Материалы и методы
Эксперименты проводились на мышах, крысах и морских свинках, приобретенных в филиале НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ – ПЛЖ «Рапполово». Животные содержались в стандартных условиях вивария с освещением 12:12, вода и корм – ad libitum.
Подготовка МКППКЧ к использованию. Образец крови непосредственно перед введением размораживали на водяной бане при температуре +37 °С и ex tempore отмывали от криосреды охлажденным до +4 °С раствором – транспортной средой (ТС): 6 мл альбумина + 19 мл физиологического раствора + 25 мл реополиглюкина («Уман альбумин» 25%, раствор для инфузий, альбумин человека; «Реополиглюкин» (декстран, ср. мол. масса 30 000-40 000), раствор для инфузий. Белмедпрепараты). В стерильных условиях клеточный материал переносили в пробирку на 50 мл и доводили охлажденной ТС до верхней метки (первые 10 мл при тщательном перемешивании, остальное – струйно). Суспензию клеток перемешивали и центрифугировали при +4 °С и 600 g в течение 10 мин. Отмывку клеток от криосреды проводили дважды. Осажденную клеточную массу разводили в необходимом объеме ТС и хранили при температуре тающего льда в течение всего периода применения (не более 2 часов).
Количество МКППКЧ рассчитывалось исходя из терапевтической дозировки для человека (600 млн клеток на 70 кг массы тела (м. т.)) и составляло, соответственно, 10-, 50- и 100-кратную дозу в пересчете на массу тела животного. Оценка развития гиперчувствительности I типа проводилась на половозрелых морских свинках (Cavia porcellus) абиссинской породы.
Статистические группы включали по 3 самца и 3 самки с массой тела 300-350 г. Непосредственно перед экспериментом животного усыпляли в CO2-боксе и декапитировали, ex tempore извлекали трахею, которую разделяли на три части по 5-8 колец в каждой. Образцы трахей инкубировали 10 мин при 37±0,2 °С в отдельных пробирках, заполненных 10 мл раствора Рингера–Тироде состава: NaCl – 0,800%, KCl – 0,020%; CaCl2 – 0,020%; NaHCO3 – 0,010%; MgCl2 – 0,010%; NaH2PO4 – 0,005%; глюкоза – 0,100%.
По окончании инкубации по 3 образца трахеи помещали в 30 мл раствора Рингера–Тироде на чашку Петри с диаметром 10 см, термостатируемую при той же температуре (всего по 18 образцов из каждой группы эксперимента), где осуществлялась экспозиция тестируемыми веществами или клеточной суспензией в течение 1 мин. Первая группа: негативный контроль (введение в область трахеи ТС); вторая – экспериментальная (суспензия МКППКЧ); третья – позитивный контроль раствор гистамина гидрохлорида (ТОО «Бурли»)). Конечные концентрации в области трахеи составляли: транспортная среда – 5%, МКППКЧ – 2,5%, гистамина дигидрохлорид – 0,002%. Весь процесс сопровождался видеофиксацией и контролем изменения размеров трахеи на масштабно-координатной чертежной бумаге с разметкой 1 × 1 мм. Интенсивность развития реакции гиперчувствительности I типа фиксировали в виде «крестов»: резко положительная реакция «++++», положительная реакция «+++», слабоположительная реакция «++», положительный результат в пределах погрешности «+», реакция отсутствует «-».
Определение антител к МКППКЧ осуществлялось на самцах мышей линии CBAxC57B2/6 с массой тела 20-25 г. Статистические группы включали по 10 особей в каждой. Первая группа: контроль 1 (внутривенное введение физиологического раствора из расчета 0,1 мл / 25 г м. т.); вторая – контроль 2 (внутривенное введение ТС из расчета 0,1 мл / 25 г м. т.); третья – экспериментальная 1 (МКППКЧ в количестве 8,57 × 107/кг м. т., ресуспендированных в ТС из расчета 0,1 мл / 25 г м. т.); четвертая – экспериментальная-2 (МКППКЧ в количестве 4,28 × 108/кг м. т., ресуспендированных в ТС из расчета 0,1 мл / 25 г м. т.); пятая – экспериментальная-3 (МКППКЧ в количестве 8,57 × 108/кг м. т., ресуспендированных в ТС из расчета 0,1 мл / 25 г м. т.); шестая – позитивный контроль (трехкратная иммунизация Staphylococcus aureus путем внутрибрюшинного введения в дозировке 5 × 105 КОЕ/животное каждые 72 часа, с последующим отбором крови из сердца под общим наркозом через 72 ч после последней инокуляция).
Через 21 день животных усыпляли в CO2-боксе и из сердца отбирали кровь без антикоагулянта. Сыворотку крови инактивировали путем нагрева на водяной бане при температуре 53 °С в течение 30 мин. Реакцию связывания комплемента (РСК) осуществляли в тест-системе, включающей эритроциты барана (ЭБ), гемолизин (сыворотка иммунизированного ЭБ кролика), исследуемую сыворотку мышей и определяемый антиген (МКППКЧ или S. aureus) [4]. Результаты оценивали по отсутствию гемолиза ЭБ и фиксировали в виде «крестов»: резко положительная реакция «++++», положительная реакция «+++», слабоположительная реакция «++», положительный результат в пределах погрешности «+», реакция отсутствует «-».
Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов после введения МКППКЧ проводилась на крысах линии Wistar. Статистические группы включали по 6 самцов и 6 самок с массой тела 180-200 г. Первая группа – контроль (внутривенное введение ТС из расчета 0,5 мл/200 г м. т.); вторая группа – экспериментальная (МКППКЧ в количестве 8,57 × 10 8/кг м. т., ресуспендированных в ТС из расчета 0,5 мл/200 г м. т.).
На 30-е сутки у животных под общим наркозом (Золетил, Франция) из сердца отбирали кровь, которую стабилизировали гепарином (ООО «Диамед-фарма», Россия), конечная концентрация 50 МЕ/мл, после чего животных усыпляли в СО2-камере. Стабилизированную кровь в объеме 100 мкл смешивали с 10 мкл 0,05% суспензии туши, приготовленной на изотоническом растворе хлорида натрия, и инкубировали при 37 °С ± 0,2 °С в течение 25 мин. После инкубации отбирали 3 мкл клеточной взвеси и готовили мазки на аппарате Vision (Австрия). Клетки фиксировали в течение 30 мин в холодной (1-4 °С) смеси, приготовленной из 96% спирта и 40% формалина в соотношении 10:1. По окончании фиксации препараты промывали дистиллированной водой и сушили.
Окрашивали 10-12 мин красителем Романовского–Гимзы. Стекла для просветления промывали в течение 5 сек 30%-ным раствором этанола. Анализировали по 100 нейтрофилов на каждое животное при 400-кратном увеличении с помощью светового микроскопа Primo Star (Zeiss). Рассчитывали фагоцитарный индекс – число нейтрофилов, поглотивших частицы туши, и фагоцитарное число – среднее количество поглощенных частиц.
Статистический анализ осуществляли в программном пакете Excel и с помощью онлайн-калькулятора (https://www.statskingdom.com/170median_mann_whitney.html). Определяли медиану (Ме), верхний и нижний квартили (Q0,25-Q0,75). Сравнение гипотез проводили по U-критерию Манна–Уитни и статистически значимыми считали результаты при p < 0,05.
Результаты
Оценка гиперчувствительности I типа к КМКППКЧ на гладких мышцах трахеобронхиальной цепочки морских свинок. В ходе определения анафилактогенной активности концентрата мононуклеарных клеток и транспортной среды в процессе экспозиции исследуемых образцов признаков бронхоспазма выявлено не было. Результаты исследований суммированы в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что мононуклеарные клетки пуповинно-плацентарной крови человека в концентрации 2,5% по объему не оказывают анафилактогенной активности, оцениваемой по сокращению гладких мышц трахеобронхиальной цепочки морских свинок к предполагаемому аллергену. Половых особенностей в реактивности к тестируемым на аллергенность клеткам не выявлено.
Оценка выработки антител к МКППКЧ у мышей
Анализ сыворотки крови мышей после введения мононуклеаров пуповинно-плацентарной крови человека показал отрицательную реакцию на антитела к тестируемому биоматериалу (табл. 2).
Из таблицы 2 следует, что слабая иммунная реакция на компоненты транспортной среды, отмечаемая в группе контроль 2, нивелируется на фоне введения мононуклеарных клеток пуповинно-плацентарной крови, в то время как у животных позитивного контроля отсутствие гемолиза в суспензии эритроцитов барана выявляет резко положительную реакцию.
Оценка влияния МКППКЧ на функциональную активность нейтрофилов
Введение крысам клеточного материала способствовало усилению фагоцитарной активности гранулоцитов (табл. 3).
Из таблицы 3 видно, что у самок на фоне введения ядросодержащих клеток пуповинной крови статистически значимо (р = 0,004) возрастает фагоцитарная активность сегментоядерных нейтрофилов на 28%; у самцов увеличение исследуемого показателя составило 13%, а различия между контрольной и экспериментальной группами соответствуют уровню статистической тенденции (р = 0,054). Фагоцитарный индекс во всех экспериментальных группах оказался в зоне естественных флуктуаций нормативных величин.
Обсуждение
Результаты исследований МКППКЧ на аллергенность и иммунотоксичность, проведенных в рамках протоколов доклинических испытаний фармакологических веществ, свидетельствуют об отсутствии негативных воздействий мононуклеаров на иммунную систему теплокровных, что обосновывает целесообразность дальнейшего (включая клинические исследования) изучения эффективности и безопасности комплекса гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток из пуповинно-плацентарной крови человека.
Оценка анафилактогенной активности МКППКЧ, осуществленная на трахеобронхиальной цепочке морских свинок, позволила выявить отсутствие аллергической реакции к клеточной суспензии со стороны гладких мышц, обеспечивающих активные движения трахеи. Это не противоречит результатам, представленным в литературных источниках [10, 19], где доказано ингибирование выброса гистамина мастоцитами под воздействием стволовых клеток.
Отрицательная реакция связывания комплемента у гибридов мышей свидетельствует об тсутствии иммунореактивности со стороны B-клеточного звена организма-хозяина на клеточный трансплантат. Причиной данного события может служить непосредственное ингибирование фракцией мезенхимальных клеток (входящих в состав МКППКЧ) пролиферации В-лимфоцитов в фазе G0/G1 посредством регуляции активности протеинкиназы p38 MAPK – ассоциируемой с индукцией апоптоза и контролем ключевых точек клеточного цикла (G2/M и G1/S) [13, 21]. В то же время известно, что клетки мезенхимального ряда способны ингибировать пролиферацию наивных Т-клеток и Т-клеток памяти даже при стимуляции поликлональными антигенами [14], что разрывает цепь в трехклеточной системе кооперации иммуноцитов в гуморальном иммунном ответе и дополнительно обеспечивает отрицательную реакцию связывания комплемента. Это также может объяснять сниженную иммунореактивность мышей по отношению к компонентам транспортной среды, в которой человеческий белок может играть ту же роль, что и бычий сывороточный альбумин, используемый в классической патофизиологической модели сывороточной болезни у грызунов [7].
Объяснением возросшей фагоцитарной активности нейтрофилов в ответ на введение животным МКППКЧ может служить выделение вводимыми стволовыми клетками цитокинов, таких как IL-6, IL-10 и др. [12], которые согласно литературным данным у человека и животных способны стимулировать фагоцитоз гранулоцитов [9].
Заключение
Согласно результатам исследований на трех видах грызунов (морские свинки, мыши, крысы), мононуклеарные клетки пуповинно-плацентарной крови человека не обладают анафилактогенным, а в 100-кратной от терапевтической дозировки (8,57 × 108 кл/кг) –иммунотоксическим действием, но способствуют росту фагоцитарной активности нейтрофилов, что требует дальнейших доклинических и клинических испытаний эффективности и безопасности применения биоматериала с высоким лечебным потенциалом.
Список литературы / References
1. Гришина В.В. Пуповинная кровь – источник стволовых клеток // Онкогематология, 2007. № 3. С. 56-60. [Grishina V.V. Umbilical cord blood is a source of stem cells. Onkogematologiya = Onkogematologiya, 2007, no. 3. pp. 56-60. (In Russ.)]
2. Масчан А.А., Масчан М.А., Новичкова Г.А., Румянцев А.Г., Калинина И.И. Острые миелоидные лейкозы: клинические рекомендации. М., 2020. 55 с. Режим доступа: https://oncology.ru/specialist/treatment/references/actual/586.pdf. [Acute myeloid leukemia: Clinical recommendations]. Moscow, 2020. 55 p. Available at: https://oncology.ru/specialist/treatment/references/actual/586.pdf.
3. Морозова Я.В., Смирнов В.Н., Макаров И.В., Емелина Д.А. Применение ядросодержащих клеток пуповинной крови в лечении регрессивного аутизма: клинический случай // Consortium Psychiatricum, 2023. Т. 4, № 4. С. 39-47. [Morozova Ya.V., Smirnov V.N., Makarov I.V., Emelina D.A. The use of nucleated cord blood cells in the treatment of regressive autism: a clinical case. Consortium psychiatricum = Consortium Psychiatricum, 2023, Vol. 4, no. 4, pp. 39-47. (In Russ.)]
4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1 / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012. С. 94-115. [Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part 1. Ed. A.N. Mironov]. Moscow: Grif i K; 2012, pp. 94-115.
5. Смирнов В.Н., Незнанов Н.Г., Морозова Я.В., Макаров И.В., Емелина Д.А., Гасанов Р.Ф., Базанович С.А. Применение концентрата ядросодержащих клеток пуповинной крови у детей с аутизмом: безопасность и эффективность метода // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуски, 2021. Т. 121, № 11-2. С. 31-37. [Smirnov V.N., Neznanov N.G., Morozova Ya.V., Makarov I.V., Emelina D.A., Gasanov R.F., Bazanovich S.A. The use of umbilical cord blood nucleated cell concentrate in children with autism: safety and effectiveness of the method. Zhurnal nevrologii i psikhiatrii im. S.S. Korsakova = S. Korsakov Journal of Neurology and Psychiatry, 2021, Vol. 121, no. 11-2, pp. 31-37. (In Russ.)]
6. Шаманская Т.В., Осипова Е.Ю., Румянцев С.А. Ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (обзор литературы) // Онкогематология, 2012. № 1. С. 35-45. [Shamanskaya T.V., Osipova E.Yu., Rumyancev S.A. Ex vivo expansion of umbilical cord blood hematopoietic stem cells (literature review). Onkogematologiya = Onkogematologiya, 2012, no. 1, pp. 35-45. (In Russ.)]
7. Arisz L., Noble B., Milgrom M., Brentjens J.R., Andres G.A. Experimental chronic serum sickness in rats. A model of immune complex glomerulonephritis and systemic immune complex deposition. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 1979, Vol. 60, no. 1, pp. 80-88.
8. Barker J.N., Wagner J.E. Umbilical cord blood transplantation: current state of the art. Curr. Opin. Oncol., 2002, Vol. 14, no. 2, pp. 160-164.
9. Gierlikowska B., Stachura A., Gierlikowski W., Demkow U. The impact of cytokines on neutrophils’ phagocytosis and NET formation during sepsis-a review. Int J Mol Sci., 2022, Vol. 23, no. 9, 5076. doi: 10.3390/ijms23095076.
10. Glenn J.D., Whartenby K.A. Mesenchymal stem cells: Emerging mechanisms of immunomodulation and therapy. World J. Stem Cells, 2014, Vol. 6, Iss. 5, pp. 526-539.
11. Gluckman E., Broxmeyer H.A., Auerbach A.D., Friedman H.S., Douglas G.W., Devergie A., Esperou H., Thierry D., Socie G., Lehn P., Cooper S., English D., Kurtzberg J., Bard J., Boyse E.A. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N. Engl. J. Med., 1989, Vol. 321, pp. 1174-1178.
12. González-González A., García-Sánchez D., Dotta M., Rodríguez-Rey J.C., Pérez-Campo F.M. Mesenchymal stem cells secretome: The cornerstone of cell-free regenerative medicine. World J. Stem Cells., 2020, Vol. 12, Iss. 12, pp. 1529-1552.
13. Han J., Wu J., Silke J. An overview of mammalian p38 mitogen-activated protein kinases, central regulators of cell stress and receptor signaling. F1000Res., 2020, Vol. 9, F1000 Faculty Rev-653. doi: 10.12688/f1000research.22092.1.
14. Jiang W., Xu J. Immune modulation by mesenchymal stem cells. Cell Prolif., 2020, Vol. 53, no. 1, e12712. doi: 10.1111/cpr.12712.
15. Niederwieser D., Baldomero H., Bazuaye N., Bupp C., Chaudhri N., Corbacioglu S., Elhaddad A., Frutos C., Galeano S., Hamad N., Hamidieh A.A., Hashmi S., Ho A., Horowitz M.M., Iida M., Jaimovich G., Karduss A., Kodera Y., Kröger N., Péffault de Latour R., Lee J.W., Martínez-Rolón J., Pasquini M.C., Passweg J., Paulson K., Seber A., Snowden J.A., Srivastava A., Szer J., Weisdorf D., Worel N., Koh M.B.C., Aljurf M., Greinix H., Atsuta Y., Saber W. One and a half million hematopoietic stem cell transplants: continuous and differential improvement in worldwide access with the use of non-identical family donors. Haematologica, 2021, Vol. 107, no. 5, pp. 1045-1053.
16. Ray S.K., Mukherjee S. Clinical practice of umbilical cord blood stem cells in transplantation and regenerative medicine – prodigious promise for imminent times. Recent Pat. Biotechnol., 2022, Vol. 16, no. 1, pp. 16-34.
17. Romanov Y.A., Tarakanov O.P., Radaev S.M., Dugina T.N., Ryaskina S.S., Darevskaya A.N., Morozova Ya.V., Khachatryan W.A., Lebedev K.E., Zotova N.S., Burkova A.S., Sukhikh G.T., Smirnov V.N. Human allogeneic AB0/Rh-identical umbilical cord blood cells in the treatment of juvenile patients with cerebral palsy. Cytotherapy, 2015, Vol. 17, no. 7, pp. 969-978.
18. Sanz J., Veys P., Rocha V. Umbilical cord blood transplantation in children and adults. In: Carreras E., Dufour C., Mohty M., Kröger N., editors. The EBMT Handbook: Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Cellular Therapies. 7th edition. Cham (CH): Springer; 2019. Chapter 64. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK554021/.
19. Sun L., Sha J., Meng C., Zhu D. Mesenchymal stem cell-based therapy for allergic rhinitis. Stem Cells Int., 2020, Vol. 2020, 2367524. doi: 10.1155/2020/2367524.
20. Ternovoy S., Ustyuzhanin D., Morozova Y., Shariya M., Roldan-Valadez E., Smirnov V. Functional MRI evince the safety and efficacy of umbilical cord blood cells therapy in patients with schizophrenia. Schizophr. Res., 2020, Vol. 224, pp. 175-177.
21. Thornton T.M., Rincon M. Non-classical p38 map kinase functions: cell cycle checkpoints and survival. Int. J. Biol. Sci., 2009, Vol. 5, no. 1, pp. 44-51.
22. Vanegas D., Galindo C.C., Páez-Gutiérrez I.A., González-Acero L.X., Medina-Valderrama P.T., Lozano J.C., Camacho-Rodríguez B., Perdomo-Arciniegas A.M. Human Leukocyte Antigen and Red Blood Cells Impact Umbilical Cord Blood CD34+ Cell Viability after Thawing. Int. J. Mol. Sci., 2019, Vol. 20, no. 19, 4875. doi: 10.3390/ijms20194875.
