Разбирая в прошлой лекции морфологию и устройство бактерий, мы выяснили, что на их основании уже можно многое сказать о принадлежности микроорганизма к тому или иному виду (идентифицировать или, на профессиональном жаргоне, «расшифровать» его). Однако чаще всего одних этих данных недостаточно.
В настоящее время идентификация бактерий в основном полагается на физиологические и биохимические свойства. Для их изучения проводится посев исследуемого биологического материала на питательные среды.
Питательные – это значит, они предоставляют бактериям место для роста и вещества для питания. О питании бактерий мы говорили в дополнительном материале по экологии микроорганизмов, и сегодня тоже будем неоднократно к нему возвращаться.
Одним из наиболее подходящих питательных веществ являются белки: да, они дают меньше выход энергии по сравнению с жирами, но столько же, сколько углеводы, и при этом прекрасно обеспечивают пластический обмен (синтез собственных структур клетки). Это справедливо как для людей (вспомните, как больных выкармливают нежирным бульоном), так и для бактерий.
Поэтому распространённым видом питательных сред являются бульоны. Например, мясо-пептонный бульон (МПБ) и пептонная вода (вы же помните, что пептиды – это коротенькие «недобелки», чьи цепочки состоят из малого количества аминокислотных остатков?).
Бульоны – это один из видов жидких питательных сред, применяемых в бактериологии. Для использования их обычно разливают в прозрачные стеклянные или пластиковые пробирки. Но не всегда удобно использовать для культивирования бактерий жидкость. Ведь характер роста в них у разных бактерий отличается: одни дают хорошо заметный осадок на дне, другие растут по всему объёму, и попробуй на глаз определи – это действительно лёгкое помутнение в результате диффузного роста, или показалось. Кроме того, в жидкой среде относительно мало кислорода, и требовательные к нему микробы могут расти только в поверхностной плёнке.
Поэтому помимо жидких используют плотные питательные среды. Если вы немного разбираетесь в кулинарии, то хорошо знаете, как можно из жидкости – сока, бульона – получить желе или холодец. Для этого нужно добавить, например, белок желатин. Желатиновые среды успешно используют в бактериологии, и по характеру их разжижения судят о росте микроорганизма. Другой вариант желирующего агента – полисахариды. Крахмал например, с которым готовят кисель. Бактериологи тоже начинали с крахмала – ещё Роберт Кох изучал рост бактерий на богатых крахмалом картофельных пластинках. Но в настоящее время подавляющее большинство плотных питательных сред готовят с применением другого полисахарида – получаемого из морских водорослей агара.
Причём именно готовят – почти как на кухне. В своё время учёные потратили много сил и времени на разработку подходящих питательных сред, буквально по граммам подбирая сочетание веществ, которое бы удовлетворило прихотливым вкусам тех или иных видов бактерий. Это закрепилось в авторских названиях многих из них – среда Эндо, агар Клиглера, агар Плоскирева, среда Олькеницкого, среда Вильсона-Блера, агар Сабуро и т.д. Но благодаря их стараниям сейчас процесс приготовления питательных сред не сильно отличается от того, как вы варите магазинный кисель из пакетика или быстрорастворимое пюре. Нужно просто высыпать в кипяток сухой готовый стерильный порошок, который уже содержит нужный набор белков, сахаров, солей и других веществ, варить по инструкции, затем процедить и разлить для застывания по пробиркам или в специальные плоские ёмкости для микробиологических посевов – вы наверняка слышали про такие чашки Петри.
Даже помещение для этих работ в микробиологической лаборатории так и называется – средоварочная или «средоварка». Только конечно все компоненты здесь отмеряют с высокой точностью, а не в духе «две столовых ложки без верха», и требования чистоты к средоварочной предъявляются повышенные – примерно как к процедурному кабинету. Чтобы облегчить процесс, иногда используют фабрично изготовленные стерилизованные чашки Петри с уже готовой разлитой средой – после культивирования и учёта результатов их просто обеззараживают и утилизируют.
Кроме плотных и жидких питательных сред иногда применяют полужидкие – содержание агара в них таково, что среда не застывает окончательно, а приобретает консистенцию крепкого киселя. Их используют, например, для определения подвижности бактерий.
Мы уже сказали, что на жидких питательных средах разные виды микроорганизмов могут расти по-разному: одни только в поверхностной плёнке, другие выпадают на дно, третьи распределяются по всему объёму. Ещё интереснее наблюдать рост колоний бактерий на плотных питательных средах. Обычно колонии бактерий округлые, диаметром от полумиллиметра до нескольких миллиметров. Они могут быть полупрозрачными, белесоватыми, окрашенными в цвет среды или продуцировать пигменты. А ещё некоторые бактерии пахнут! Не всегда приятно, но бывают удивительные исключения – возбудитель гнойных осложнений в хирургических ранах бактерия синегнойная палочка, выращенная в чистой культуре, вкусно пахнет земляничным мылом. Форма колоний тоже может быть необычной, отличаться от привычной круглой. Для их описания бактериологи придумали множество образных поэтических названий: форма цветка маргаритки, форма львиной гривы, колонии типа «яичница-глазунья» и т.п. Ведь раньше у учёных не было телефонов с фотоаппаратами, чтобы быстро показать коллегами, что они увидели в посеве, и приходилось всё описывать словами, в лучшем случае – делать рисунки.
Вся совокупность признаков, которыми характеризуется рост бактерий на питательных средах (размер, форма, цвет, запах колоний, изменение среды вокруг них и т.п.), называется культуральными свойствами.
Каждая колония на питательной среде вырастает из одной материнской клетки. Если очень тщательно отмерить исходное количество биологического материала для посева, то подсчитав затем число колоний на чашке и решив несложную пропорцию, можно сказать, сколько колоний содержится в одном грамме или одном миллилитре исходного биологического материала. Такой метод учёта результатов называется количественным и выражается в колониеобразующих единицах (КОЕ/г, КОЕ/мл). Ведь нормальное содержание бактерий разных видов, например, в кишечном содержимом известно. Если одних вдруг стало меньше или они исчезли, уступив место другим, можно говорить о дисбактериозе.
Но прежде чем начать «считать бактерии по головам», нам ещё нужно «узнать их в лицо». Ведь не все из них дают характерный рост на обычных средах, а некоторые привереды и вовсе не желают расти на простых (универсальных) питательных средах вроде МПА, или их в посеве забивают другие виды. Вот как раз тут учёные и практические микробиологи вовсю начинают пользоваться изученными ранее биохимическими свойствами бактерий, подбирая нужные питательные среды для выделения именно тех видов, которые наиболее интересуют в рамках конкретной диагностической ситуации.
Например, чтобы ингибировать рост посторонней микрофлоры, которая станет мешать проведению исследования, в питательные среды добавляют антибиотики и другие специальные вещества. Например, желточно-солевой агар (среда ЖСА) имеет высокое содержание соли, что крайне осложняет жизнь многим микроорганизмам, но вот стафилококки на нём прекрасно растут. Среда Эндо приготовлена так, чтобы наоборот – ингибировать рост грам«+» флоры, тех же кокков, для лучшего выделения энтеробактерий. Такие среды называют селективными (селекция – отбор).
В качестве удобного источника энергии бактерии, как и мы, с удовольствием используют простые сахара. Представители обширного семейства энтеробактерий, куда входит уже известная вам кишечная палочка, в большинстве своём являются нормальными представителями кишечной микрофлоры, что отражено в их названии («энтерон» - кишечник). И почти все могут окислять как глюкозу, так и лактозу (молочный сахар), образующиеся при гидролизе пищевых сахаров. Но вот большинство патогенов из этого семейства лактозу «не переваривают». Поэтому, если в скошенный в пробирке столбик агара добавить глюкозо-лактозную смесь, и провести посев изучаемой культуры бактерий уколом в среду и одновременно по скошенной поверхности среды (анаэробные и аэробные условия), то растущие добропорядочные энтеробактерии «съедят» весь доступный сахар – исходно малиново-красная среда в пробирке закислится продуктами реакции и содержащийся в ней пигмент-индикатор сменит окраску на жёлтую. Но если в первичном посеве были возбудители кишечных инфекций – сальмонеллы или шигеллы, не окисляющие лактозу – то оставшиеся ярко-красными «язычки» скошенной среды просигнализируют бактериологу: «Внимание! Опасность!»
Такого рода питательные среды, помогающие отличать одни бактерии от других, называют дифференциально-диагностическими. Одновременно могут быть и селективными по отношению к определённым группам бактерий – такие среды называют комбинированными. Не всегда они основаны только на биохимическом отношении к углеводам: например, висмут-сульфитный агар (среда ВСА) и ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар (вместо этого непроизносимого названия все пользуются торговым наименованием XLD-агар) выявляют способность сальмонелл продуцировать сероводород. Реагируя с компонентами этих сред, он окрашивает колонии сальмонелл в чёрный цвет. Правда, сероводород ещё выделяют бактерии рода протей. И их приходится дифференцировать от сальмонелл другими тестами.
Если же от бактериолога требуется не просто отличить протей от сальмонеллы, а сказать: это Proteus vulgaris или, скажем, Proteus mirabilis, то нужно будет провести ряд дополнительных биохимических тестов. Поскольку как вы уже поняли, для лёгкого выявления биохимических реакций используют цветные индикаторы, то ряд пробирок с результатами этих тестов бактериологи называют «пёстрым рядом». Более современные варианты метода предполагают использование вместо пробирок с растворами специальных полимерных пластин с лунками, или бумажных полосок, на которые уже нанесены отмерянные количества субстрата и требуется только добавить бактериальную взвесь. Такие методы уже можно автоматизировать и реализовать в виде «умного» аппарата – бактериологического анализатора.
Есть ещё специальные среды, используемые при проведении определённых видов исследований: например, агар Гивенталя-Ведьминой (среда АГВ) и Мюллера-Хинтон агар (МХА) используют для определения чувствительности бактерий к антибиотикам диско-диффузионным методом.
В конечно итоге все направлено на то, чтобы используя те или иные наборы биохимических тестов и ключи для их расшифровки, с уверенностью сказать – какую бактерию мы выделили из клинического материала.
Однако если на ваших чашках Петри вовсе ничего не выросло, то это ещё не значит, что в исследуемом материале не было бактерий. Ведь пока мы дали им только кров и пищу (да и то в надежде, что угадали их аппетиты). Да, посев будет инкубироваться 18-24 часа (а иногда и больше) в термостате при температуре 370 Цельсия. Большинству бактерий очень нравится температура человеческого тела, хотя есть и такие, которым нужны 25 или 48 градусов. Но что если бактериям не нравится… воздух?
Говоря об экологии микробов, мы уже упоминали, что ряд из них не выживает в присутствии кислорода воздуха – это т.н. облигатные анаэробы. Другие приспособились к смене атмосферы – факультативно-анаэробные бактерии. В рамках последней группы есть такие представители, которым кислород всё таки нужен, но в очень небольшой концентрации – микроаэрофилы, а есть те, кому вынь-да-положь повышенное содержание углекислого газа (капнофилы). В общем, бактерии те ещё привереды. И для культивирования анаэробов бактериологам приходится прибегать к самым разным ухищрениям. Иногда достаточно жидких сред, которые и так плохо насыщаются кислородом, а если ещё добавить туда подходящий пористый материал, поглощающий газы – например, кусочки говяжьей печени – то вполне можно растить некоторые анаэробные бактерии. Описанным образом работает среда Китта-Тароцци для культивирования возбудителя газовой гангрены и других клостридий.
Но чаще приходится использовать специальные герметичные сосуды – эксикаторы и анаэростаты – где бескислородная среда создаётся за счёт горящей свечи или в ходе химической реакции карбонатов с сильной кислотой. Хотя наиболее удобным и современным способом является использование газогенерирующих пакетов «Газпак», которые за счёт всё тех же химических реакций создают в герметичном объёме анаэростата атмосферу требуемого химического состава.
Всё, о чём мы говорили выше, относилось к бактериям. Похожие принципы можно использовать и для культивирования грибов (но не груздей, естественно, а микроскопических: плесени порой и так прорастают на чашках с бактериальными посевами, мешая исследованию). Вирусы на питательных средах не растут, поскольку не могут жить самостоятельно, но их можно вырастить на подходящей культуре клеток (а бактериофаги – на бактериальном мате, хотя это тоже своего рода культура клеток, только бактериальных).
Однако есть такие бактерии, которые либо совсем не растут на питательных средах (в прошлой лекции мы упоминали микоплазмы и риккетсии), либо растут очень плохо и очень медленно (туберкулёзная микобактерия, бактерия-возбудитель лепры и др.). Их приходится диагностировать либо по микроскопии образцов, либо определяя реакцию на них иммунной системы (серодиагностка), либо призывая на помощь учёных из других областей. Например, союз микробиологов и физиков дал в руки первых не только электронный микроскоп, но и масс-спектрометр – аппарат, позволяющий определить химический состав образца по спектру излучения входящих в него атомов.
Может быть вся эта «кухня» покажется вам сложной, но примеры этапов бактериологического исследования приведены здесь для того, чтобы дать вам понимание общей сути и логики процесса. С конкретными нюансами вы познакомитесь, если решите посвятить себя миру микробов и придёте работать в микробиологическую лабораторию.
©Алекс Шел, сентябрь 2022 г. При копировании и использовании материалов ссылка на источник обязательна
