Различные образцы клинических симптомов, отека и эритемы (также могут вызвать очаговое накопление гноя или жидкости) были отобраны у сорока пациентов в больнице Бенха и были протестированы на выделение штаммов S. aureus. Мазки переносили с питательными средами, проходя вверх и вниз по зараженным участкам. Образцы инкубировали в течение 48 ч при 37 ° С. Мазки были приготовлены в трех экземплярах для каждого образца.
Образцы переносили из тампона и инокулировали на поверхность питательного агара чашки Петри методом штриховки и инкубировали при 37 ° С в течение 48 ч для выделения бактерий. Отдельную колонию высевали на среду с кровяным агаром и инкубировали при 37 ° С. Чистые культуры уникальных типов колоний были получены и сохранены для дальнейшего анализа. Выделенные бактерии были идентифицированы и классифицированы на основе их морфологических и биохимических свойств следующих - определителе бактериологии, а также биохимического анализа. Кроме того, метод анализа Vitek(Франция) был применен после биохимических испытаний в качестве подтверждающего теста для идентификации бактерий, аэробных и факультативных бактерий.
Мазки, богатые питательной средой и дважды проходящие вверх и вниз при очаговом скоплении гноя или жидкости, использовали для инокуляции колб, содержащих питательный бульон. Колбы встряхивали на роторном шейкере в течение 72 часов при комнатной температуре при 3000 об/мин в течение 20 минут. Колбы инокулировали изолятами при культуре лог-фазы приблизительно 4 × 106 КОЕ/мл в питательном глюкозном бульоне (2,0 г/л дрожжей и 2,5 г/л глюкозы) для достижения множественности инфекции в диапазоне от 0,02 до 2,0. В культурах колбы инкубировали и непрерывно перемешивали в течение ночи при 37 ° С во встряхивающем инкубаторе. Бактериальные клетки и осколки удаляли центрифугированием при 6000 об / мин в течение 15 минут. Полученную суспензию фагов размножали методом анализа на бляшках с получением по меньшей мере 108 БОЕ/мл. Фаговые смеси состояли из четырех фаговых изолятов и имели приблизительный конечный титр 1×1010 БОЕ/мл. Фаговые смеси хранили в 2 мл пробирке Эппендорфа при 4 ° С в полной темноте.
Просвечивающий электронный микроскоп (TEM) использовали для обнаружения фагов, специфичных для S. aureus, с использованием метода отрицательного окрашивания 1% -ным водным ацетатом мочи. Сетки высушивали на воздухе и исследовали с помощью TEM в Региональном центре микологии Университета Аль-Азхар, Египет.
S. aureus разбавляли в стерильной дистиллированной воде до плотности 107 КОЕ/мл и инокулировали на чашки с питательным агаром. Капля фага (20 мкл) каждого изолята была наслоена на агар. Планшеты инкубировали при 28 ° С в течение ночи. Чистый сливной лизис и мутный сливной лизис были зарегистрированы как положительный результат, тогда как чрезвычайно слабые зоны считались отрицательным результатом. Крем для кожи, состоящий из стерической кислоты 6%; пропиленгликоль 3%; парафиновое масло 7%; изопропилмиристат 3%; токоферола ацетат 0,5% и розмарин 0,2% обессоленные в воде.
Культуру S. aureus собирали с чашек с питательным агаром через 24 ч после инокуляции и суспендировали в стерильной воде и доводили до A660 = 0,5 с помощью спектрофотометра, который приблизительно равен 108 КОЕ / мл. Три чашки Петри каждой обработки инокулировали бактериальной суспензией с использованием ручного пластикового распылителя до полного увлажнения. Смеси фаговых суспензий корректировали с помощью спектрофотометра, который приблизительно составляет 1 × 1010 БОЕ/мл и используется для биологической обработки как в рецептуре, так и в рецептуре. А также три чашки Петри были без фагов в качестве контроля. Инокулированные чашки Петри инкубировали в ростовом инкубаторе при 37 ° С в течение 48 часов.
Метод тканевой культуральной пластинки, используемый в качестве количественного теста, считается золотым стандартом противовирулентной активности специфического обнаружения фагов против изолята S. aureus и определения жизнеспособных клеток следующим образом.
Фагосвободная косметическая и фаговая дополненная косметика анализировались на предмет их способности предотвращать образование биопленки золотистого стафилококка изолята. Клетки бактерий добавляли в 200 мл среды соевого бульона триптиказы во время инокуляции, и клеткам давали возможность образовать биопленку. Косметическое средство и/или фаги добавляли к изоляту S. aureus с помощью 50 мкл косметического средства; 50 мкл специфического фага см/(5×105 БОЕ/мл) и 100 мкл изолята S. aureus. Отдельные лунки с плоским дном полистирольного планшета для культуры ткани заполняли 150 мкл обработанного S. aureus, Лунки с отрицательным контролем заполняли 150 мкл бульона со средой положительного бактериального контроля. Планшет инкубировали при 37 ° С в течение 24 часов.
После инкубационного периода содержимое каждой лунки удаляли (свободно плавающие бактерии), осторожно постукивая. Лунки промывали три раза 2,0 мл солевого фосфатного буфера (рН 7,2) и затем сушили. Биопленка, образованная бактериями, прилипшими к лункам, фиксировалась 2% ацетатом натрия и окрашивалась кристаллическим фиолетовым (0,1%). Избыток окраски удаляли путем промывания дистиллированной водой, а затем высушивали и хранили. Оптическую плотность (OD) окрашенной прилипшей биопленки получали с использованием микролитрового планшет-ридера ELISA на длине волны 570 нм. Эксперимент проводили трижды и повторяли три раза.
