Рекомендации по фиксации гистологических препаратов
Резюме
Фиксация – первый и самый длительный этап приготовления гистологического препарата. Небрежное отношение к этому этапу в 95% случаев приводит к необратимым последствиям, что существенно ограничивает возможности морфологической диагностики. В статье последовательно перечисляются моменты, соблюдение которых всеми участниками диагностического процесса в итоге приведет к возможности получения морфологического заключения практически любого уровня, включая высокотехнологичные методы.
Введение.
В наше время фиксация ткани может производиться разными способами, в зависимости от оснащённости медицинского учреждения, в частности кабинета, где берут материал и патоморфологической лаборатории, взаимосвязи между ними и требованиям к скорости выдачи заключения. Однако, срок выдачи гистологического заключения невозможно сократить за счет этапа фиксации, как бы этого ни требовали любые экономические обстоятельства.
В то же время, существуют исследования, доказывающие, что самый длительный процесс обработки ткани можно ускорить без потери качества фиксируемых образцов [9], но для использования этой информации необходимы ответственность и понимание процессов, происходящих в ткани при фиксации, а также адекватный выбор фиксатора. Ведь большинство фиксаторов имеют определенные, и, как правило, специфичные цели.
Основная часть
Из всего многообразия фиксаторов, предложенных с середины XVIII века и до середины XX (это почти 600 растворов) самым конкурентоспособным, компромиссным и массово используемым на сегодняшний день остается 10% нейтральный забуференный формалин. Его использование для гистологических исследований регламентировано приказами МЗ РФ №179н от 24 марта 2016 и МЗ РФ №354н от 6 июня 2013г. Он позволяет получить достоверные и воспроизводимые результаты как для простых рутинных исследований, так и для большинства высокотехнологичных методов и молекулярно-генетических тестов. Это подтверждается десятками тысяч ежедневых исследований, выполняемых с учетом всех правил фиксации.
Вместе с этим, ежедневно выполняются гораздо больше исследований с нарушениями этих правил, тем самым закрывая путь ко многим высокотехнологичным видам исследований.
Соблюдение правил фиксации - задача довольно тривиальная, в самом же этапе фиксации нет ничего сложного. Есть некоторые моменты, которые необходимо знать и соблюдать для получения репрезентативных препаратов [2,3], особенно при иммуногистохимическомокрашивании. Эти пункты перечислены ниже.
1. Фиксатор должен быть из одного источника и в отделении, забирающем материал, и в лаборатории, его исследующей. Тип фиксатора рекомендует гистологическая лаборатория.
2. Первичная фиксация происходит в отделении, где производится забор исследуемого образца ткани от пациента. Важно в максимально короткий срок от момента взятия исследуемого объекта поместить его в фиксирующий раствор.
Тут дело в том, что моментально после иссечения объекта в нем начинаются аутолитические процессы: клетки разрушаются под действием своих же ферментов, и такая аутолизированная ткань будет непригодна для гистологических и иммуногистохимических исследований.
3. Ответственность за сохранность и пригодность для диагностики этих объектов несет врач, взявший материал.
4. Далее материал транспортируют в лабораторию - время доставки должно быть максимально быстрым.
5. С момента приема образцов ткани в лаборатории, ответственность за все ложится на персонал лаборатории (были ли соблюдены правила фиксации, правильно ли указаны тип фиксатора, время погружения в фиксатор, время доставки в лабораторию и тд).
6. Крайне важно понимать, что фиксация ткани является таким же необратимым процессом, как и вырезка материала. Но, если при вырезке материал можно оставить в запас, и при необходимости использовать, то ошибки на этапе фиксации необратимы. Также следует соблюдать соотношение ткани и фиксирующей жидкости, оно должно быть 1/20.
7. Обо всех этих важных тонкостях необходимо информировать хирургов и его помощников, которым поручено доставить материал в лабораторию, а также обязательно ставить в известность специалистов по закупке расходных материалов.
Что нужно сделать, чтобы улучшить качество фиксации на лабораторном этапе?
1. Узаконить использование фиксатора в СОП лаборатории.
2. Убедиться в том, что для работы закуплен качественный фиксатор.
3. Заливать вырезанные образцы только свежим фиксатором и только однократно. При увеличении количества смен формалина дополнительная диффузия или иное улучшение не происходит вопреки ожиданиям. Также бесполезно пропускание исследуемых объектов через 2 и более дополнительные станции с формалином. Такой расход формалина считается неоправданным.
4. Следует понимать, что не все типы тканей одинаково хорошо фиксируются, вследствие чего некоторые типы ткани требуют особых условий вырезки [6]. Например, кости содержат очень мало воды, но много минерализованного внеклеточного вещества, поэтому требуют фиксации не менее 48-72 часов. Также формалин с трудом проникает через неповрежденную кожу, поэтому любые опухоли кожи, даже малых размеров, должны быть обязательно разрезаны или надрезаны [4].
5. Для облегчения процесса вырезки следует использовать специальные инструменты, существенно облегающие этот процесс.
6. Для хорошей фиксации образцов за 24 часа [9] оптимально вырезать образцы ткани не толще 3 мм (жировую ткань и кожу следует вырезать не толще 2 мм). В этих объектах имеется множество соединительнотканных мембран, через которые диффузия формалина и любых других жидкостей существенно затрудняется при большей толщине. Такой уровень толщины наряду с заполнением кассеты не более 75% её внутреннего объема считается оптимальным также по следующим соображениям:
- свободное расположение объекта в кассете позволяет реактивам легко проникать в кусочек и из него;
- объем материала достаточен для получения нескольких сотен срезов толщиной 2-5 мкм, даже при условии неоднократной подрезки;
- расписание проводки можно оптимально подобрать для проводки большинства разнородных хирургических объектов по ночному расписанию, проводя их в одном запуске, и это важно с точки зрения затрат времени на исследование и реактивов.
Обсуждение
Итак, основные правила фиксации - это скорое помещение в фиксирующую жидкость образца после взятия, соотношение ткани и фиксатора 1/20, вырезка объектов не толще 3мм, заполнение объёма гистологической кассеты тканью не более, чем на 75 %, а также однократное использование фиксатора [4,5]. Таким образом, основная ответственность в процессе вырезки возлагается на патологов, вырезающих материал. И от этого момента главным образом зависит простота и четкость исполнения всех остальных этапов гистологического исследования. Поэтому о правилах фиксации материала необходимо информировать врачей-патологов, чтобы они понимали ответственность и влияние выполняемой ими процедуры вырезки на длительный, важный этап фиксации, где несоблюдение правил и рекомендаций по фиксации материала чаще всего заканчивается аутолизом.
Рекомендации по фиксации базируются на законах физики (диффузия) и химии (ковалентное и перекрестное связывание белков) [1]. Фиксация - это химическая реакция, а проникновение формалина в ткань – физический процесс. Проникновение формалина в кусочек толщиной 3 мм завершается за 3 часа, а фиксация требует не менее 24 часов при комнатной температуре или 18 часов при 37оС. Увеличение температуры более 37оС не ускоряет фиксацию, а при температуре выше 50оС белки подвергаются термической коагуляции [7]. Эта коагуляция впоследствии не позволяет провести ряд высокотехнологичных исследований, например, ИГХ и FISH.
В силу геометрических ограничений (размеры кассеты, предметного стекла) подавляющее большинство объектов для исследования требуют подрезания их до соответствующих размеров. Поэтому материал, поступающий в лабораторию, вырезается и помещается в формалин, где происходит вторичная фиксация, ведь формалин не проникает ни в какие биологические объекты глубже 1 см (и это через несколько дней) [8]. Иначе, приходится иметь дело с объектами, пропитанными сверху формалином, а внутри аутолизированными.
Из этого правила есть исключение - объект не более 2 мм в диаметре, находившийся в фиксаторе не менее 24 часов (если это не папиллома или другая опухоль кожи с неповрежденным эпидермисом) не требует вторичной фиксации и может быть запущен в проводку сразу после кассетирования образца и промывки в воде.
Выводы:
1. Ткань начинает подвергаться аутолизу в момент ее извлечения из организма человека, поэтому фиксация должна быть начата как можно раньше.
2. Ответственность за сохранность образцов до приема их лабораторией несет врач, забравший материал у пациента.
3. Общеупотребительный и многоцелевой фиксатор – 10% нейтральный забуференный формалин. Его использование узаконено соответствующими юридическими документами.
4. Фиксация формалином в гистологической лаборатории подчиняется законам физики, химии и геометрии и может быть ускорена без повреждения исследуемых образцов только увеличением температуры до 37оС, но никакими другими способами.
5. Для качественной фиксации объекта размерами не более 2х2х0,3 мм достаточно одной смены фиксатора, 24-72 часов (18 часов при температуре 37оС).
• После фиксации рекомендуется промывка кассет с материалом в проточной воде в течение 30-60 минут.
Литература:
1. Dapson R. W., Formaldehyde: past, present and future. Histo-Logic, Vol. XXXIV, №1, May 2001.
2. Мальков П.Г., Франк Г.А., Пальцев М.А., Стандартные технологические процедуры при проведении патолого-анатомических исследований. Клинические рекомендации RPS1.1(2016) / Российское общество патологоанатомов Москва, Практическая медицина, Москва.
3. Dietel, M., Wittekind, C., Bussolati, G., von Winterfeld, M. (Eds.). Preanalytics of pathology specimens in oncology. Springer Verlag, 2015.
4. Г. А. Франк, П. Г. Мальков (ред). 101 шаг на пути к успеху в гистологии / Geoffrey O. Rolls et al.: Пер. с англ /. Leica Microsystems Vetzlar, Germany, 2012
5. Yaziji H., Taylor C. R., Goldstein N. S., Dabbs D. J.,Hammond H. E., Hewlett B., Floyd A. D., Barry T. S.,Martin A. W., Badve S., Baehner F., Cartun R. W.Eisen R. N., Swanson P. E., Hewitt S. H. Vyberg M.,Hick D. G., Consensus Recommendations on Estrogen Receptor Testing in Breast Cancer By Immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 16(6):513-520.
6. Dimmenstein I.B., Bone grossing techniques: helpful hints and procedures. Ann Diagn Pathol., 2008, Jun;12(3):191-8.
7. Buesa R.J. Histology without formalin? Ann DiagnPathol., 2008 Dec; 12(6):387-96.
8. Thompson S.W., Luna L. G. An atlas of artifacts encountered in the preparation of microscopic tissue sections. Springfield (Ill.)? 1978.
9. Fox C. H., Johnson F. B., Whiting J., Roller P. P.,Formaldehyde fixation. Journal of histochemistry and cytochemistry, 33(8), 845–853.
