Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) — серологический метод, широко используемый для обнаружения вирусного гемагглютинина (гемагглютинирующего вируса) или отличий в его структуре у различных вирусов с помощью антигемагглютинирующих антител, образовавшихся в организме животных в процессе болезни или в результате иммунизации.
РТГА впервые предложена Херстом в 1941 г. для вирусов гриппа в США, обнаружившим у них способность агглютинировать эритроциты. Позже обнаружили, что многие вирусы обладают гемагглютинирующей активностью, и РТГА начали широко применять как для идентификации вирусов, так и для серологического подтверждения вирусной природы болезни путем обнаружения антител.
РТГА основана на том, что при контакте вируса с гомологичными (специфическими) антителами происходит связывание антител с гемагглютининами вируса, образуется комплекс «антиген+ антитело». При этом нейтрализуется не только инфекционная, но и гемагглютинирующая активность вируса, в результате чего вирус теряет свойство агглютинировать (склеивать) эритроциты. Таким образом, метод позволяет идентифицировать вирус или выявить противовирусные антитела в сыворотке крови.
Сыворотки крови животных содержат различные полисахариды, включающие сиаловые кислоты, которые могут прикрепляться к гемагглютинину вируса гриппа и затруднять связывание специфических в отношении гриппа гемагглютинирующих антител. Для удаления этих неспецифических ингибиторов гемагглютинации образцы сыворотки обрабатываются ферментом RDE, разрушающим сиаловые кислоты.
Поскольку РТГА основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.
Гемагглютинация — это процесс, при котором вирусный поверхностный белок гемагглютинин связывается с сайтом сиаловой кислоты на поверхности красных кровяных телец (эритроцитов), заставляя их агглютинировать.
Агглютина́ция (лат. agglutinatio — «приклеивание») — склеивание и выпадение в осадок из однородной взвеси эритроцитов, несущих антигены.
Когда антитела против конкретного белка гемагглютинина (ГA) связываются с антигенными сайтами белка ГA, эти сайты блокируются и, следовательно, не могут связываться с эритроцитами. Это последующее ингибирование гемагглютинации лежит в основе теста РГА.
Вирус гриппа вызывает гемагглютинацию эритроцитов курицы. Присутствие сывороточных антител к этим вирусам может быть установлено путем демонстрации ингибирования этой агглютинации.
Плохое качество образца сыворотки может повлиять на интерпретацию результатов.
Для постановки РТГА необходимы следующие компоненты:
1) вирусный антиген (гемагглютинирующий вирус) в рабочей дозе 4ГАЕ (4 гемагглютинирующие единицы вируса в объеме 0,25 мл физиологического раствора);
2) неизвестная исследуемая или известная диагностическая сыворотка крови, прогретая при 56 °С в течение 30 мин для ингибирования термолабильных ингибиторов;
3) нормальная сыворотка крови — контрольная, не содержащая специфических антител;
4) специфическая сыворотка крови – контрольная, содержащая специфические антитела;
5)1% суспензия эритроцитов полученных от петухов (свободных от патогенной микрофлоры);
6) физиологический раствор рН 7,0-7,2.
Порядок постановки РТГА.
Сначала разводят антигены, согласно инструкции, затем проверяют титр этих антигенов (1ГАЕ) методом РГА (подготовительный этап). Для работы готовят рабочую дозу антигена (4ГАЕ) и проверяют правильность подготовленного антигена. Для этого ставят контроль в пять лунок. В первую лунку капают рабочую дозу антигена (4ГАЕ), во вторую – 4ГАЕ и физиологический раствор, в третью, четвертую и пятую лунки просто физиологический раствор. Затем титруют начиная со второй лунки до пятой. Во все лунки вносят эритроциты. Результат оценивают через 30 минут инкубирования.
Положительная реакция гемагглютинации оценивается по форме осадка эритроцитов, которые оседают, образую «зонтик». В случае отрицательной реакции, так же как и в контроле, эритроциты оседают, образуя на дне «пуговку».
В первых трех лунках должны быть «зонтики», в четвертой допускается частичная агглютинация, в пятой должна быть полная агглютинация («пуговка»). Если что-то пошло не так, то исправляют рабочую дозу антигена путем добавления физиологического раствора, либо путем добавления антигена (1ГАЕ). Вновь ставят контроли и смотрят на результат. Повторяют столько раз, пока не будет необходимого результата разведения рабочей дозы антигена.
После проверки рабочей дозы (4ГАЕ), ставят РТГА с исследуемыми сыворотками крови. В микропланшет вносят физиологический раствор, в первые лунки добавляют исследуемые сыворотки, титруют до конца плашки, затем во все лунки вносят рабочую дозу антигена, инкубируют в течение 30 минут, далее во все лунки вносят эритроциты.
Результат оценивают через 30 минут инкубирования, наклонив планшет под углом от 45°Сдо 60°С. Осевшие эритроциты в колонке должны "потечь" и образовать каплю.
Если произошло взаимодействие антиген/антитело, гемагглютинация эритроцитов будет ингибирована. Для записи данных следует пользоваться следующими знаками: знак "+" – для полной гемагглютинации ("зонтик"), знак "+/-" – для частичной гемагглютинации и знак "-" – для торможения гемагглютинации ("пуговка").
Титр в РТГА соответствует наибольшему разведению сыворотки, которое полностью тормозит гемагглютинацию (последняя «пуговка»). Положительным считается титр антител 1:16 и выше.
Интерпретация агглютинированных/неагглютинированных лунок является субъективной и может варьироваться между операторами. По этой причине, результаты проверяются вторым оператором, чтобы подтвердить точность определенной конечной точки.
Результат контроля — осадок эритроцитов в виде развернутого «зонтика» на дне лунки, что означает отрицательную РТГА. Известно, что механизм реакции гемагглютинации основан на способности гемагглютинирующих вирусов адсорбироваться на поверхностных рецепторах эритроцитов различных видов животных и птиц. В результате такой адсорбции эритроциты склеиваются друг с другом и выпадают в осадок в виде развернутого «зонтика» на дне лунки — это положительная РГА. Первое отличие РТГА от РГА: если суспензию эритроцитов внесли в жидкость без гемагглютинирующего вируса, то эритроциты оседают в виде небольшого красного плотного осадка с четкими краями. Второе отличие между двумя этими реакциями заключается в том, что РТГА позволяет идентифицировать выделенный вирус, а РГА — лишь обнаруживать наличие гемагглютинирующего вируса в исследуемом материале.
Метод РТГА очень специфичен и «капризен». Для успешного прохождения реакции необходимо убедиться, что эритроциты, отобранные у петуха, качественные, физиологический раствор, который используется для разведения с рН не менее 7,0 и не более 7,2. Многократное замораживание компонентов набора не допускается. Необходимо тщательно подготовить исследуемые пробы сыворотки крови, удалить ингибиторы, иначе реакция может не пойти.
Но, тем не менее, при правильной подготовке к данному методу, метод исследования простой и эффективный.
В ГБУ РК "Республиканская ветлаборатория" РТГА используется для обнаружения антител к гемагглютинирующим вирусам и для характеристики изолятов гриппа птиц (ГП). РТГА так же используют в качестве исследований на напряженность иммунитета после вакцинации.
После вспышки гриппа птиц, было принято решение вакцинировать домашнюю птицу в угрожаемой зоне. По окончании периода, необходимого для выработки антител, от вакцинированной домашней птицы были отобраны пробы сыворотки крови. Они были доставлены в нашу лабораторию для исследований на напряженность иммунитета. При постановке РТГА были выявлены антитела в титрах от 1:4 до 1:64. Достаточная напряженность иммунитета, при которой положительная РТГА наблюдалась в титрах выше 1:16 отмечена у 56% исследованных птиц. Это позволило сделать заключение о не достаточном поствакцинальном иммунитете антител (минимально допустимый уровень составляет 80%) и необходимости проведения повторной вакцинации. Работа продолжается.
