Продолжение
2.4. РТ-ПЦР в реальном времени
Общая РНК была выделена из клеток с помощью SV Total RNA Isolation System (Promega, Madison, WI, USA). Примерно равное количество общей РНК было реверсно транскрибировано в кднк с помощью обратной транскриптазы. РТ-ПЦР в реальном времени проводили на Термоциклере Dice® Real Time Systemⅱ (TaKaRa, Shiga, Japan), используя 2 × SYBR premix EX Taqⅱ (TaKaRa), кднк и соответствующие наборы праймеров. Праймерные последовательности, используемые для анализа RT-ПЦР в реальном времени, были следующими: β-актин (смысл: 5 '- ATG GGT CAG AAG GAC TCC TAC-3', антисенс: 5 '- ACG CTC GGT CAG GAT CTT CAT-3'); TNF-α (смысл: 5'-CGG GGT GAT CGG TCC CCA AAG-3', антисмысл: 5'-GGA GGG CGT TGG CGC GCT GG-3'); интерлейкин-1β (IL-1β; смысл: 5'-CCT CTC CCA AGC TTC CT-3', антисмысл: 5'-TTT GGA AGC AGC CCT TCA TC-3'); ИЛ-6 (смысл: 5'-TTC TAC CCC AAT TTC CAA TGC-3', АНТИСМЫСЛ: 5'-ACT AAC GCA CTA GGT TTG CCG-3'). Каждый цикл РТ-ПЦР в реальном времени состоял из стадии денатурации (95 °C, 10 С), стадии отжига за 10 с (55 °C для β-актина, ФНО-α и Ил-1β; и 53 °C для ИЛ-6) и стадии удлинения (72 °C, 20 с). После усиления был проведен анализ кривой плавления для проверки точности формирования ампликона. β-актин был выбран в качестве гена домашнего хозяйства для нормализации. Значения порогового цикла (Ct) были получены и использованы для анализа ΔΔCt. Относительное количество мРНК каждого целевого гена, нормализованной к гену housekeeping, рассчитывали как 2 −(ΔCt цитокин-ΔCt ген housekeeping). Было получено кратное изменение мРНК каждого целевого гена относительно контроля и рассчитано как 2-ΔΔCt, где-ΔΔCt = (Ct cytokine − Ct housekeeping gene) обработанный - (CT cytokine-Ct housekeeping gene) необработанный.
2.5. Цитокиновый анализ
Уровень цитокинов в супернатантах культур определяли с помощью коммерческих наборов ELISA для определения ФНО-α, Ил-1β и ИЛ-6 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Для определения уровня Ил-1β добавляли АТФ (5 мм), который присутствовал в течение последних 3 ч стимуляции ЛПС.
2.6. Анализ NBT / глицината
Для обнаружения Белк-связанных хинонов (хинопротеинов) был проведен анализ NBT/glycinate, как описано ранее с некоторой модификацией ( Yoshioka et al., 2016). Вкратце, клетки БВ-2 лизировали лизирующим буфером, содержащим 10 мм фосфата натрия (рН 7,4), 138 мм хлорида натрия, 2,7 мм хлорида калия, 1% НП-40, 0,5% дезоксихолата натрия и 0,1% додецилсульфата натрия (СДС). Каждый клеточный лизат (100 мкг белка/100 мкл) добавляли к 1 мл реагента NBT (0,24 мм NBT в 2 м глицинате калия, рН 10,0), а затем смесь инкубировали в темноте в течение 2 ч на Шейкере. Поглощение сине-фиолетового цвета, полученного в реакционной смеси, измеряли при 530 Нм.
2.7. Транзиторная трансфекция и анализ репортера люциферазы
Клетки BV-2 трансфицировали с помощью репортерной плазмиды люциферазы (NF-kB-Luc, Clontech Laboratories Inc., Palo Aito, CA, USA) путем использование Lipofectamine LTX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) согласно протоколу изготовления. Через 24 ч после трансфекции клетки обрабатывали 30 мкм дофамином в течение 24 ч с последующей обработкой 10 мкг/мл ЛПС в течение 6 ч. люциферазную активность лизатов клеток определяли люминометрически с помощью реагента системы люциферазного анализа (Promega). Активность люциферазы нормализовали до содержания белка в экстрактах. Относительная активность люциферазы определялась как отражающая транскрипционную активность NF-kB, выраженную в виде кратного увеличения относительно активности необработанных регуляторов.
2.8. Получение субклеточных экстрактов
Клетки BV-2 и клетки микроглии мыши в первичной культуре лизировали лизирующим буфером, состоящим из 10 мм HEPES-KOH (pH 7,5), 1% NP-40, 1,5 мм MgCl 2 , 10 мм KCl, 500 мкм дитиотреитола (DTT) и 1 мм фенилметилсульфонилфторида. После инкубации на льду в течение 20 мин цитоплазматический экстракт получали в виде супернатанта центрифугированием лизатов (500× g, 5 мин, 4 °с). Гранулы промывали лизисным буфером и снова центрифугировали. Ядерные гранулы ресуспендировали в лизисном буфере, состоящем из 20 мм Трис-HCl (рН 7,5) и 2% SDS. Затем суспензию кипятили в течение 10 мин. После центрифугирования (17 400× g , 5 мин, 20 °C) в качестве супернатанта был получен ядерный экстракт. Для получения цельных белковых экстрактов клетки лизировали буфером, состоящим из 20 мм Трис-HCl (рН 7,5) и 2% SDS. Лизаты кипятят в течение 10 мин. Весь экстракт был получен в качестве супернатанта после центрифугирования (17 400× g, 5 мин, 20 °C).
2.9. Анализ западных пятен
Образцы белка (1-10 мкг)были нанесены на мембрану из поливинилидендифторида после разделения белков по SDS-странице. Затем мембрану промывали 3 раза Трис-буферным физиологическим раствором (TBS)/0,05% Tween-20 и блокировали в течение 1 ч с 1-5% нежирного сухого молока/TBS / 0,05% Tween-20. Затем его инкубировали в течение ночи при 4 °C с требуемым первичным антителом (разведение 1:1000-5000). Далее мембрану 3 раза промывали TBS/0,05% Tween-20, а затем инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с конъюгированным с пероксидазой хрена анти-кроличьим IgG поликлональным антителом (Cappel, West Chester, PA, USA). Сигналы были обнаружены с помощью набора для детектирования хемилюминесценции (NEN Life Science Products, Boston, MA, USA). После обнаружения мембрану репробировали КОНЪЮГИРОВАННЫМ с HRP анти-β-актиновым антителом (разведение 1: 10000, Abcam, Cambridge, MA, USA) или окрашивали coomassie brilliant blue (CBB). Интенсивности полос были проанализированы денситометрически с помощью программного обеспечения ImageJ. Интенсивность полосы каждого образца нормировали к соответствующей интенсивности β-актиновой полосы или CBB-окрашенной для получения относительного содержания белка.
