2.5. Препараты для эксперимента 2-роли K Ca , K ATP и K V каналов
Вторая экспериментальная сессия была предназначена для определения роли K Ca , K ATP и K V каналов в веноартериолярном рефлексе. Четыре микродиализ волокон непрерывно заливали в случайном порядке с: 1) лактированного раствора Рингера (контроль), 2) 50 мм tetraethylammonium (Сигма-Алдрич), неселективный КСа каналов блокатор, 3) 5 мм glybenclamide (Сигма-Алдрич), селективный кАТФ каналов блокатор, или 4) 10 мм 4-аминопиридина (Сигма-Алдрич), неспецифический Кв блокиратор каналов. Каждый препарат непрерывно перфузировали со скоростью 4,0 мкл / мин на протяжении всего эксперимента, за исключением того, что 50 мм нитропруссида натрия вводили на заключительных этапах протокола для индуцирования максимальной вазодилатации (см. ниже). Все растворы, специфичные для данного участка, перфузировали не менее чем за 80 мин до начала проведения веноартериолярных рефлекторных тестов для установления блокады всех трех к + каналов. Этот период также достаточен для транзиторной кожной гиперемии, связанной с размещением волокон ( Anderson et al., 1994) и 10 мм 4-аминопиридина ( Fujii et al., 2017) спадать. Концентрация тетраэтиламмония ( Brunt et al., 2013; Fujii et al., 2016; Kutz et al., 2015 ; Lorenzo and Minson, 2007), глыбенкламид ( Fujii et al., 2016; Kutz et al., 2015 ), и 4-аминопиридин ( Fujii et al., 2016 ) были определены на основе предыдущих исследований. Для растворения нерастворимого в воде глибенкламида в лактированном растворе Рингера (Fujii et al.) использовали комбинацию 5% диметилсульфоксида (Sigma-Aldrich) и высокого рН (~11)., 2017). РН регулировали путем добавления гидроксида натрия (Sigma-Aldrich) к лактированному раствору Рингера. Ранее мы сообщали, что комбинация 5% диметилсульфоксида и РН ~11 не оказывала влияния на кожно-сосудистые реакции ( Fujii et al., 2017). Тем не менее, чтобы свести к минимуму потенциальное влияние этой комбинации на веноартериолярный рефлекс, все Сайт-специфические препараты были растворены в 5% диметилсульфоксиде с рН ~11.
2.6. Тест веноартериального рефлекса
После >75 мин фармакологического введения в каждом эксперименте начиналась оценка веноартериолярного рефлекса, при этом участники оставались сидеть в полулежачем положении. Предплечье располагалось на уровне сердца, чтобы избежать влияния гидростатического давления. Первоначально было проведено 3-минутное базовое измерение. После этого на обработанное (с введением фармакологических препаратов через вставленные микродиализные зонды) предплечье в течение 3 мин накладывали венозную окклюзию 45 мм рт.ст. Для выявления веноартериолярного рефлекса. Поскольку венозное давление >25 мм рт.ст. требуется для того, чтобы вызвать веноартериолярный рефлекс (Henriksen, 1991), в настоящем исследовании было использовано манжеточное давление 45 мм рт. ст., соответствующее предыдущей работе ( Davison et al., 2004). Это давление также ниже диастолического артериального давления и, таким образом, оказало минимальное влияние на артериальное давление. По истечении этого 3-минутного периода манжета была выпущена. Затем во все четыре участка кожи вводили 50 мм нитропруссида натрия (Sigma-Aldrich) со скоростью 6,0 мкл/мин, что продолжалось приблизительно 20-30 мин до достижения устойчивого плато в течение 2 мин, которое определялось как максимальный кожный кровоток. В 5 минутах краткая артериальной окклюзии 240 мм рт. ст. проводилась также оценка постокклюзионного реактивная гиперемия после завершения venoarteriolar рефлекс тест, результаты которого отражаются в другом месте (П = 14 для эксперимента 2 в данном исследовании в качестве пост-окклюзионной реактивной гиперемией был не успешно получается в 1 из 15 участников) (Фуджи и соавт., 2019). В настоящем исследовании основное внимание уделялось данным веноартериолярного рефлекса.
2.7. Измерения
Индекс кожного кровотока, выраженный в перфузионных единицах, измеряли с помощью лазерно-доплеровской флоуметрии (PeriFlux System 5000, Perimed, Стокгольм, Швеция) при частоте дискретизации 32 Гц. В держатель лазерно-доплеровского зонда, охватывающего каждое микродиализное волокно, был помещен интегрированный лазерно-доплеровский расходометрический зонд с 7-ми лазерной решеткой (модель 413, Perimed).
2.8. Анализ данных
Данные и статистический анализ соответствуют рекомендациям по экспериментальному проектированию и анализу в фармакологии (Curtis et al., 2018). Переменные для веноартериолярного рефлекса были оценены с помощью Microsoft Excel 2016. Реакция веноартериолярного рефлекса от репрезентативного индивида со всеми идентифицированными переменными веноартериолярного рефлекса показана на Рис.2. 1. Исходные данные получали путем усреднения доокклюзионного кожного кровотока в течение 3 мин. Снижение кожного кровотока при венозной окклюзии определялось как минимальное. Изменение кожного кровотока между исходным и минимальным значениями определялось как амплитуда. Амплитуда также была представлена в виде процентного изменения от исходного уровня. Время, прошедшее от начала венозной окклюзии до 50% и 100% минимального уровня, оценивалось как время до 50% минимального и время до минимума, соответственно. Также оценивали площадь под кривой ниже исходного уровня во время венозной окклюзии. Кожный кровоток, полученный при проведении веноартериолярного рефлекторного теста, нормализовали в пределах участка путем определения максимального значения, полученного при введении нитропруссида натрия, как 100%. Этот подход рекомендуется для минимизации межузельных вариаций кожного кровотока ( Minson, 2010).
