Клещевые заболевания вызываются инфекционными агентами, передающимися через укусы клещей. Клещевые заболевания могут быть вызваны риккетсией или другими видами бактерий, а также вирусами и другими патогенами. Географическое распределение и генотипы Coxella Burnetii и риккетсии отличаются между различными видами клещей, которые происходят в Эфиопии, что предполагает, что могут быть пациенты с клещевыми заболеваниями неизвестной этиологии в этой стране. Трансмиссивные заболевания клещей вызывают серьезные проблемы со здоровьем скота и диких животных, особенно в Африке к югу от Сахары. Есть много видов клещей видов, включая Amblyomma gemma, Rhipicephalus appendiculatus найдены на скоте и диких животных в Танзании, и патогены, такие как Анаплазма маргинал и Babesia bigemina были найдены в клещей.
Черные носороги находятся под угрозой исчезновения. В 2012 году Элиска, черный носорог, родилась в чешском зоопарке Двур Кралове и переехала в национальный парк "Мкомази" в Танзании. Хотя средняя продолжительность жизни черных носорогов составляет от 35 до 50 лет, Элиска внезапно умерла в 2016 году. Клещи были найдены на трупе Элиски, и они были собраны и отправлены в лабораторию Arthropods банка медицинского значения, Медицинский колледж Йонсейского университета, Сеул, Корея, где мы определили виды клещей. Далее проанализировали микробиомы клещей с помощью 16S рРНК мишенью высокой производительности секвенирования для оценки того, клещей были ли патогенные бактерии, которые могли бы объяснить внезапную смерть Eliska. Мы также собрали и проанализировали несколько клещей с поля, где жила Элиска, чтобы сравнить микробиом клещей, собранных с поля и с тела Элиски.
Материалы и методы
1. Тиковая коллекция с тела Элиски и окружающего поля
Одновременно, три полностью поглощенных клещей были собраны с тела Элиски и четыре клеща были собраны с поля, окружающего тело в национальном парке Мкомази, Танзания, в 2016 году. Четыре полевых образца были собраны путем выделения. Все клещи, использованные в этом исследовании, были в их взрослой стадии. Каждая поверхность клещей была стерилизована спиртом сразу же после сбора, и клещи были затем индивидуально сохранены. Образцы были переданы в лабораторию в Корее, и их поверхности были снова промыты спиртом. Клещи были затем индивидуально дроблены и ДНК немедленно извлечены.
2. Морфологическая идентификация клещей
Клещи были определены как Amblyomma драгоценных камней на основе морфологии под стереомикроскопией. Морфологические характеристики A. gemma включают плоские глаза и тонкие связи между центральными и боковыми пятнами. Образцы Amblyomma gemma также имеют пунктуации среднего размера в передней части щита. Все клещи находились во взрослой стадии, и клещи, собранные с тела Элиски, были полностью поглощены.
3. Извлечение ДНК из клещей
Общее количество ДНК было получено с помощью комплекта ДНК насекомых NucleoSpin в соответствии с инструкциями производителя. Каждый клещевой образец помещался отдельно в бисероплетку и подавался в следующие этапы: лизис клеток, связывание ДНК с кремнеземной мембраной, промывка, а затем сушка кремнеземной мембраны. ДНК, выделенная из каждой пробы, была элюирована в буфере элюирования на сайте 20 ㎕ . Вся обработка и секвенирование образцов проводилась на чистой скамье, под стерилизованным колпаком и в помещении, свободном от ДНК. Использовались советы Autoclaved 200 ㎕ и 1000 ㎕. Количественную оценку концентрации ДНК проводили с использованием нанокапельницы. Извлеченная ДНК хранилась при температуре -80 °C в морозильной камере.
4. Биоинформатика и статистика
Сырые показания обрабатывались путем проверки качества, а низкие показания фильтровались с помощью Trimmomatic 0,32. Данные парной последовательности были впоследствии объединены с помощью PandaSeq. Затем грунтовку обрезали с помощью собственной программы ChunLab, применяя порог сходства 0,8. Деноминация последовательностей проводилась с помощью программы предварительного кластеризации Мотур, которая объединяет последовательности и извлекает уникальные последовательности, позволяя получить до двух различий между последовательностями. База данных EzBioCloud использовалась для таксономического назначения с помощью BLAST 2.2.22, и для расчета сходства были получены парные выравнивания. Алгоритм UCHIME и нехимерическая база данных 16S рРНК EzTaxon были использованы для обнаружения химерных последовательностей при чтении с лучшим коэффициентом сходства результатов <97%. В ChunLab в качестве химер на основе нехимерной базы данных соответствующего региона были обнаружены скопления и синглоны, которые были обнаружены при сходстве менее 97% на стадии назначения таксонов. Использованная здесь БД основана на различных базах данных, таких как NCBI и ChunLab DB. Инструмент "usearch" биоинформатики в ChunLab использовался для непосредственного удаления химерных чтений. Затем данные о последовательности группировались с использованием CD-Hit и UCLUST.
Результаты
Среднее количество чтений, приписываемых бактериям, составило 20 091 чтение, приписываемое 110 видам клещей, собранных с тела Элиски. Для клещей, собранных с поля, среднее число считываний, назначенных бактериям, составило 64 687 считываний, назначенных 260 видам. Кривая разрежения всех образцов образовала плато. Количество OTU существенно не отличалось между двумя группами тиков. Филогенетический индекс был значительно выше для клещей, собранных с поля, чем для клещей, собранных с тела Eliska. В отличие от Пьелоу и Шеннон индексы были значительно выше в клещей, собранных с тела Eliska, чем в клещей, собранных с поля.
Результаты PCoA показывают, что клещи, собранные с тела Элиски, были более плотно распределены, чем клещи, собранные с поля. Это указывает на то, что клещи, собранные с тела Eliska в большей степени сходство в бактериальном составе, чем клещей, собранных с поля. Кроме того, с помощью PERMANOVA была обнаружена существенная разница в составе микроорганизмов между двумя группами клещей. Этот анализ подтвердил, что тот факт, что клещи были собраны с тела Eliska, был важным фактором в определении микробиомного состава. PERMANOVA - это непараметрический статистический тест на различия между многомерными наборами данных в центроиде или дисперсии групп.
Что касается бактериальных таксонов, обнаруженных в двух группах клещей, то на видовом уровне четыре вида бактерий Bacillus составили 55,95% и 89,67% от общего числа клещей, собранных с тела Элиски и с поля, соответственно. В клещах, собранных с поля, бактерии, которые составляли более 1% от общего количества прочитанного, включали B. chungangensis (87,14%) и B. pumilus (2,17%). В клещей, собранных с тела Eliska, бактерии, которые составляли более 1% от общего числа читал, включая B. cereus (19,86%), Lysinibacillus sphaericus (16,64%), B. pumilus (15,82%), Virgibacillus proomii (12.10%), B. subtilis (9,81%), B. chungangensis (7,45%), R. Stabekisii (3,28%), S. Silvestris (2,87%), Terribacillus saccharophilus (2,41%), Sporosarcina koreensis (1,38%).
