Гены, вызывающие рак, — это измененные гены белков, играющих важную роль в нормальных клетках. Онкогенные белки приводят к развитию рака, имитируя действие нормальных белков.
Вступление
Онкогены —т.е. гены, вызывающие рак, — это измененные обычные, «доброкачественные» гены, присущие нормальным клеткам.
Что же делает их онкогенными? Подобно другим генам, они кодируют белки — вещества, которые составляют основу всех структур клетки, катализируют проходящие в ней реакции и, следовательно, определяют как форму клетки, так и ее функции. Белки, кодируемые онкогенами, функционируют аномально и каким-то образом предопределяют трансформацию нормальной клетки в раковую.
Что представляют собой эти онкогенные белки и каким образом они трансформируют клетки? В результате интенсивных исследований, особенно в последние десять лет, начинают проясняться общие принципы действия трансформирующих белков; полученные данные позволяют предполагать, что число различных механизмов канцерогенеза невелико, и можно надеяться, что в недалеком будущем эти механизмы будут расшифрованы.
Онкогены были открыты в результате двух, вначале совершенно несвязанных между собой, направлений исследований, которые, однако, привели к близким результатам:
- Первое направление — изучение ретровирусов. Это вирусы, у которых генетическим материалом является не ДНК, а РНК; на ней после заражения клетки животного вирусом в процессе обратной транскрипции синтезируется ДНК. У некоторых ретровирусов среди генов есть такие, которые вызывают быстрое развитие опухолей у животных. Впервые подобный ген был обнаружен в начале 70-х годов в составе вируса саркомы (“RSV”), вызывающего рак у цыплят; ген назвали “src” — от слова «саркома».
В 1975 г. М. Бишоп и Г. Вармус из Медицинской школы Калифорнийского университета в Сан-Франциско установили, что ген “src” в действительности не является вирусным геном. Он представляет собой почти точную копию нормального гена, присутствующего во всех клетках цыплят.
- За последние пять лет другое направление исследований также привело к открытию онкогенов, но уже не у ретровирусов, а в клетках опухолей животных и человека. Р. Вайнберг из Массачусетского технологического института, Дж. Купер из Института рака Даны—Фарбера, М. Уиглер из Лаборатории в Колд-Спринг-Харборе, М. Барбасид из Национального института рака и их сотрудники независимо обнаружили в ДНК различных опухолевых клеток гены, которые будучи введены методом трансфекции в нормальные клетки в культуре трансформируют их в раковые клетки.
Эти онкогены также оказались почти точными копиями протоонкогенов. Возможно, что каждый из выделенных онкогенов был причиной возникновения опухоли, в которой он был найден.
Единая группа генов
Опухоли человека, в которых обнаружены онкогены, развиваются не при индукции ретровирусами, поэтому не было оснований полагать, что онкогены из опухолей и из ретровирусов одинаковы.
И все-таки, как выяснилось, эти две группы частично перекрываются. Наиболее часто встречающийся в опухолях онкоген оказался гомологичным ретровирусному онкогену “ras”, который переносится вирусом саркомы мышей Харви.
Гены, гомологичные некоторым другим онкогенам ретровирусов, обнаружены в несколько измененной форме в клетках отдельных опухолей человека, хотя в этих случаях прямо не показано, что измененные гены вызывают опухоли. По-видимому, и при изучении ретровирусов и в опытах по трансфекции перед исследователями предстали гены из одной и той же группы нормальных генов, которые могут активироваться и становиться раковыми генами.
Группа эта, видимо, невелика. Некоторые онкогены были выделены уже по нескольку раз, так что, по всей вероятности число еще не найденных онкогенов мало. Из общего набора генов человека, которых, согласно оценкам, около 30 тыс., настоящими протоонкогенами являются, вероятно, менее 100.
Общим свойством для них оказалась эволюционная консервативность. Например, протоонкоген src есть не только у всех позвоночных животных, но и у дрозофилы, протоонкоген “ras” имеется у самых различных организмов — от дрожжей до человека. Столь высокая степень консервативности указывает на то, что протоонкогены играют в клетке важную роль.
Каким образом протоонкогены становятся онкогенами? Получены данные, свидетельствующие о нескольких механизмах. В некоторых случаях, возможно, под действием канцерогена, протоонкоген претерпевает мутацию (известно, что большая часть канцерогенов — это мутагены); при этом белок, кодируемый получившимся онкогеном, слегка отличается от нормального белка.
Например, Вайнберг и Барбасид установили, что по последовательности нуклеотидов выделенный ими онкоген ras отличается от соответствующего протоонкогена лишь в одном положении. Каждый кодон в ДНК, состоящий из трех нуклеотидов, определяет одну из 20 аминокислот, из которых построены белки. Мутация в гене “ras” приводит к замене единственной аминокислоты в белке — продукте гена, превращая нормальный белок в онкогенный.
Протеинкиназы
Каким бы ни был конкретный механизм, превращающий протоонкоген в онкоген, действие онкогена в конечном счете должно проявляться через функцию закодированного в нем белка.
Существенные данные об онкобелках были получены Р. Эриксоном и М. Коллеттом. Выделив в 1978 г. белок “p60src” из клеток, зараженных “RSV”, они обнаружили у него ферментативную активность: “p60src” катализировал присоединение фосфатных групп к другим белкам.
Установление этого факта имело большое значение, поскольку уже было известно, что фосфорилирование — важный способ регуляции функций белков. Ферменты, которые фосфорилируют белки, носят название протеинкиназ.
Они переносят богатую энергией концевую фосфатную группу от аденозинтрифосфата, основного макроэргического соединения в клетке, на молекулу белка, подвергающегося модификации.
Когда выяснилось, что “p60src” является протеинкиназой, было уже выделено и охарактеризовано несколько других ферментов с такой же активностью. Предполагалось, что “p60src”, подобно изученным ферментам, присоединяет фосфат к одной из двух аминокислот — либо к серину, либо к треонину; в боковой цепи у этих аминокислот имеется гидроксильная группа, к которой и присоединяется фосфат.
Белки-мишени
Какие белки в зараженных ретровирусами клетках содержат фосфотирозин?
Купер и Сефтон начали поиск таких белков в двух направлениях. Во-первых, они обратились к белкам, обладающим специфическими функциями, изменениями которых можно было бы объяснить некоторые свойства злокачественных клеток.
Например, клетки, трансформированные опухолеродным вирусом, по форме сильно отличаются от незараженных родительских клеток. Это позволило предположить, что изменен цитоскелет, т.е. внутренний каркас клетки. За последние десять лет были очищены некоторые белки цитоскелета.
Что если среди них есть субстрат трансформирующей тирозиновой протеинкиназы? В сотрудничестве с С. Синджером из Калифорнийского университета в Сан- Диего ученые выделили 10 белков цитоскелета из клеток, трансформированных “RSV”.
Среди них фосфотирозин был обнаружен только в винкулине. Этот белок и в нормальных клетках содержит некоторое количество фосфотирозина, но в трансформированных клетках степень его фосфорилирования больше в 20 раз.
Винкулин находится в адгезивных бляшках — особых небольших участках на нижней стороне клетки, которые прочно прилипают к поверхности, на которой она растет. Пронизывающие клетку пучки микрофиламентов цитоскелета, построенные из белка актина, заканчиваются в адгезивных бляшках.
Винкулин располагается между плазматической мембраной клетки и концами актиновых пучков; возможно, он соединяет пучки с гипотетическим мембранным белком, служащим якорем всей конструкции. Л. Роршнайдер из Центра по изучению рака Ф. Хатчинсона в Сиэтле обнаружил, что “p60src” локализован в адгезивных бляшках, где способен фосфорилировать винкулин.
В трансформированных клетках усиленное фосфорилирование остатков тирозина в молекулах винкулина, вероятно, пагубно влияет на его функцию связующего звена. Действительно, в таких клетках наблюдается сильная дезорганизация актиновых микрофиламентов.
Однако некоторые данные, полученные Роршнайдером, свидетельствуют о том, что фосфорилирования винкулина недостаточно для подобных нарушений. Может быть, требуется также фосфорилирование других белков в адгезивных бляшках.
Факторы роста
Пожалуй, наиболее поразительное свойство опухолевых клеток — это их способность к безостановочному делению.
Каким-то образом им удается ускользать от действия систем регуляции, которые не позволяют клеткам делиться слишком часто или неограниченно долго. Некоторые системы контроля обеспечиваются внеклеточными факторами роста и ингибиторами, циркулирующими в кровотоке.
Лучше других изучены два из них — фактор роста эпидермиса (ФРЭ) и фактор роста тромбоцитов (ФРТ). Они передают клетке сигнал, связываясь с молекулами специфических белков-рецепторов, погруженными в плазматическую мембрану клетки. Если какой-либо из этих факторов роста добавить к культуре неделящихся клеток, это заставит клетки поделиться один раз.
Белок — рецептор ФРЭ был обнаружен и очищен С. Коэном и его коллегами (Медицинская школа Университета Вандербильта). Они обнаружили, что ему сопутствует протеинкиназная активность, причем она тирозин специфична и стимулируется, когда молекула ФРЭ связывается с рецептором.
Недавно было показано, что и связывание ФРЭ, и фосфорилирование клеточных белков по тирозину — функции самой молекулы рецептора. Этот белок пронизывает мембрану: часть молекулы, находящаяся на наружной поверхности клетки, узнает ФРЭ, а каталитический домен внутри клетки осуществляет фосфорилирование.
Присоединение ФРЭ служит сигналом к усилению протеинкиназной активности каталитического домена на другой стороне мембраны. Рецептор ФРТ тоже обладает подобной ферментативной активностью; возможно, это действительно общее свойство всех рецепторов факторов роста.
Купер установил, что, если к клеткам с соответствующими рецепторами добавить ФРЭ или ФРТ, в клеточных белках возрастает содержание фосфотирозина. На основании этого можно думать, что сигнал к делению передается от рецептора внутрь клетки посредством фосфорилирования по тирозину белка-мишени (или ряда таких белков).
Тот факт, что усиление фосфорилирования по тирозину характерно не только для нормальных клеток при действии на них факторов роста, но и для клеток, трансформированных вирусами, позволяет строить далеко идущие предположения.
Так, возможно, что кодируемые онкогенами протеин-киназы узурпируют некоторые механизмы регуляции роста, фосфорилируя белки-мишени, которые в норме узнает протеинкиназа в составе рецептора, и в результате зараженные клетки начинают безостановочно делиться.