Исследовали икру и личинок различных рыб: камбалы-калкан P. maxima maeotica, полученную в лабораторных условиях методом, а также бычка-цуцика Proterorhiniis marmoratus, бычка -кругляка К melanostomus, собачки-павлина Lipovhrvs pavo, собачки желто-красной Blennius sanguinolentas - собранную в акватории. Стадии зрелости икры определяли по:
- 1 этап - дробление от оплодотворения до образования бластулы.
- 2 этап - эпителиальная бластула, бластомены смешены в поверхностный слой и образуется многослойная пластинка, прикрывающая бластоцель.
- 3 этап - обрастание желтка бласто диска и гастоуляция, закладываются зародышевые органы, замыкается бластопор.
- 4 этап - зародышевая полоска. Обособляются голова, нервный тяж, намечается хорда, мозговые пузыри, глазные бокалы, слуховые капсулы, начинается сегментация тела.
- 5 этап- рост хвостового отдела. Начинается отделение хвоста от желтка. Образуется сердце, зачатки кишечника, печени. Намечается плавниковая кайма, этап продолжается до начала пульсации сердца.
- 6 этап - подвижный эмбрион. Одновременно с пульсацией сердца начинаются слабые движения эмбриона. Ткани мидий исследовали непосредственно после отлова, устриц замораживали и хранили при -20°С.
Икру получали в искусственных условиях после предварительной стимуляции нереста путем выдерживания мидий при температуре +4°С в течение суток. Идотей исследовали после отлова. Покоящиеся цисты аргемии, собранные в соленых озерах Крыма, подвергали гидратации в течение 2-х часов в пресной воде, после чего получали науплиев в лабораторных условиях при инкубации гидратированных цист в течение 48 часов в воде соленостью 35 г/л при температуре 25°С. Взрослых рачков отлавливали в озере Сасык-Сиваш или подращивали в искусственных условиях по методу. Яйца креветок получали от взрослых животных непосредственно после отлова. Рыб после отлова (за исключением акул) с целью аксимации выдерживали в течение 1-3 суток в бассейнах с проточной морской водой, после чего исследовали органы и ткани.
Икру рыб в течение развития помещали в аквариумы с проточной морской водой. У дельфинов забор крови осуществляли из хвостовой артерии. Органы и ткани гидробионтов, а также икру промывали холодным 0. 85%-ным раствором хлорида натрия и гомогенизировали в нем полученные образцы при температуре 0+4°С. Гомогенаты центрифугировали при 10 ООО g в течение 15-30 минут при температуре 0+4°С. Кровь у рыб брали пастеровской пипеткой из хвостовой артерии. Сыворотку отделяли способом отстаивания и центрифугирования на холоду в течение 15 минут при 3000 об/мин. Гемолизаты эритроцитов получали путем трехкратного промывания суспензии эритроцитов 0. 85%-ным раствором хлорида натрия и последующего гемолиза дистиллированной водой в соотношении эритроцит-вода 1: 5.
Методы исследования водорастворимых экстрактов тканей. Определение содержания белка в экстрактах проводили биу-ретовым методом и по способу Лоури. Активность ферментов. Анализ ферментативной активности осуществляли на спектрофотометре Specol-211 (фирма Cari Zeiss, íena, Германия). Определение липоксигепат проводили по методу, с использованием 0. 01%-ного раствора каротина в смеси: этанол: ацетон 1: 1. Реакцию проводили в кювете спектрофотометра и запускали путем добавления 0. 4 мл 0. 03%-ной кислоты. Определение 8Н-соединений и 8Н - групп Определение глутатиона проводили с помощью аллоксанового реактива по методу. Электрофоретические исследования Электрофорез экстрактов тканей и сыворотки крови рыб проводили в 7%-ном геле полиакриламида по методу Дэвиса в приборе конструкции, электродный буфер трис-глининовый рН 8. 3.
Окрашивание электрофореграмм на общие белковые фракции проводили 0. 5%-ным раствором Ку- масси G-250 в 12. 5%-ном растворе ТХУ. Детекцию липопротеидов проводили по методу с помощью предварительной инкубации пробы в насыщенном растворе Судана черного в этиленгликоле в соотношении 3: 1 на холоду в течение суток. Железосодержащие фракции выявляли по методу Кларка с применением бензидинового реактива, окисляемого перекисью водорода. В качестве катализаторов реакции выступают тканевые и сывороточные металлопротеиды, которые окрашиваются в синий цвет. Обнаружение медьсодержащих белков проводили по методу, основанному на способности церулонлазмииа окисляться дианизидином.
При инкубации гель-злектрофореграмм в смеси 1%-ного раствора дианизидина: кошт соляной кислоты: ацетатного буфера рН 5. 7: воде в соотношении 1: 1: 3: 5 в зоне локализации медьсодержащих компонентов развивалось желтое окрашивание. Распределение белковых фракций учитывали по коэффициенту относительной электрофорегаческой подвижности Кэф, рассчитанному по отношению расстояния от старта до белковой полосы к расстоянию, пройденному в геле свидетелем (0. 001%-ный раствор бромфенолового синего, добавленного непосредственно в катодный электролит). На основании Кэф были определены стандартные электрофоретические спектры (ЭФ-спектры) белков и белковых комплексов, когда фракции учитывали при появлении полосы с данным Кэф не менее, чем в 60% случаев.
