Ретроны — важная часть врожденного иммунитета бактерий
Израильские ученые в ходе многоступенчатых экспериментов расшифровали функции и механизм работы ретронов — загадочных генетических элементов у бактерий. Ретроны кодируют химерную молекулу, состоящую из РНК и одноцепочечной ДНК, и вместе с ними — ген обратной транскриптазы. Оставалось загадкой, зачем бактерии такие странные химеры. Как выяснилось, они осуществляют широкую противовирусную защиту бактерий. В отличие от системы приобретенного иммунитета, связанного с системой CRISPR, ретроны являются одной из частей врожденного иммунитета у бактерий. В состав ретронов помимо предшественника комплекса из РНК и ДНК, а также обратной транскриптазы, входит ген эффекторного белка. При инфицировании бактериальной клетки этот эффектор активируется и очень быстро убивает клетку, так что вирусы не успевают размножиться и заразить соседей. Данное исследование показывает широчайшие перспективы возможного использования ретронной системы для решения как медицинских задач, так и для понимания эволюции живого мира.
В концу 80-х годов прошлого века в цитоплазме интересной социальной бактерии Myxococcus xanthus были обнаружены многочисленные копии одноцепочечной ДНК, не связанные с ее кольцевой ДНК. При этом каждый такой кусочек ДНК был двумя концами прицеплен к фрагменту РНК. Стало еще интереснее, когда выяснилось, что эта ДНК считывается с РНК, а не наоборот — РНК с ДНК. Этот комплекс получил наименование msДНК (msDNA) — сокращение от multicopy single-stranded DNA.
Считывание ДНК с РНК катализируется особым ферментом — обратной транскриптазой (этот фермент также называют ретро-транскриптазой). Оказалось, что в геноме бактерий эта обратная транскриптаза считывается вместе с предшественником msДНК, составляя один оперон. Такой оперон назвали ретроном (retrone), обратная транскриптаза нужна здесь для превращения РНК-предшественника в полноценную msДНК. Однако назначение странного химерного комплекса из одноцепочечной ДНК и РНК оставалось загадкой. Было ясно лишь, что эту химеру не следует относить к мобильным элементам, так как в отличие от мобильных элементов ретроны «прописаны» в бактериальной ДНК и не перемещаются из клетки в клетку. У бактерий найдены десятки ретронов, различающиеся своей ДНК-последовательностью.
Синтез химерной РНК-ДНК молекулы (msДНК). РНК показана красным цветом, одноцепочечная ДНК — черным цветом. А — РНК сворачивается в петлю, формируя доступную валентную связь с остатком гуанозина; в этой конфигурации она становится доступной для обратной транскриптазы. В — от остатка гуанозина стартует синтез цепочки ДНК, он катализируется обратной транскриптазой. Одновременно происходит деградация комплементарных нуклеотидов цепочки РНК. С — синтез заканчивается, конец цепочки ДНК остается комплементарно присоединенным к нескольким нуклеотидам на конце РНК. Схема с сайта en.wikipedia.org
Группа специалистов из института Вейцмана (Израиль) под руководством Ротема Сорека (Rotem Sorek) наконец разгадали функцию (или, вероятно, одну из функций) этой загадочной композиции. Забегая вперед, замечу, что эта химерная молекула служит для защиты от вирусной инфекции. Если CRISPR-система обеспечивает бактерии приобретенный иммунитет, то действие msДНК похоже на врожденный иммунитет.
Итак, в чем суть исследования (изложенного на редкость ясно и последовательно в порядке развития самой идеи).
Ученые начали с поиска ретро-транскриптаз в клетках модельного штамма E. coli. Особое внимание они уделили так называемым «островкам защиты», участкам ДНК, где сосредоточены гены, кодирующие инструменты противостояния разным инфекциям. На этих островках располагаются, например, гены CRISPR. Действительно, на этих участках нашелся ген ретро-транскриптазы, имеющий, как показал поиск в базах данных, аналоги у множества других бактерий. Вместе с ним считывался и ген эндонуклеазы (она разрезает ДНК на кусочки). Между ретро-транскриптазой и эндонуклеазой располагался предшественник msДНК. Иными словами, ученые выявили ретрон.
Естественно было предположить, что этот ретрон вместе с эндонуклеазой, раз они находятся в пределах «островка защиты», выполняют вместе какую-то защитную функцию. Чтобы это доказать, использовали три изготовленных штамма: с мутантной РНК-частью, с мутацией в точке начала обратной транскрипции ДНК (то есть у мутанта отсутствовала ДНК-часть химерной молекулы) и с мутантной эндонуклеазой. Все три варианта показали низкую или нулевую резистентность к предъявленным типам вирусов, зато исходный штамм к этим вирусам был устойчив. Так было доказано, что данная связка «ретрон + эндонуклеаза» нужна для защиты от вирусной инфекции, и что эта защита обеспечивается всем комплексом (РНК + ДНК + эндонуклеаза), а не его отдельными компонентами.
Следующий вопрос, логично вытекающий из предыдущего заключения: можно ли защитную функцию конкретного ретрона распространять на остальные ретроны? Ведь вполне вероятно, что защитной функцией обладает лишь один из них. Ответ был утвердительный: «да, можно, защитную функцию выполняет большинство ретронов». Это выяснили, когда поискали гомологи обратных транскриптаз, входящих в состав известных ретронов в геномах 38 167 бактерий и архей. Нашлись 4802 таких гомолога, и большинство их располагается именно в пределах «островков защиты». Иными словами, ретроны идут в комплекте с другими защитными системами бактерий. К слову, у архей ретроны присутствуют лишь в 1% из изученных геномов, тогда как у большинства бактерий они имеются.
В ходе поиска по геномным базам данных обнаружилась еще одна важная деталь. Выяснилось, что подавляющее большинство ретронов считывается вместе с другими компонентами — эндо- и экзонуклеазами, трансмембранными белками, рибозилтрансферазой и т. д. Всего выявлено 10 типов таких ассоциированных с ретронами добавок — эффекторов. В случае с первым изученным ретроном таким эффектором послужила эндонуклеаза. Ретрон, как подчеркивают исследователи, представляет собой не двухкомпонентную систему, а трехкомпонентную, к прежним двум с необходимостью добавляется эффектор.
Теперь нужно было подтвердить защитную функцию ретронов не с помощью теории и статистики, а в реальном эксперименте. И заметьте, без скорректированного представления о строении ретрона как трехкомпонентной системы этот эксперимент никогда бы не получился. А с новым пониманием все прошло отлично. Для эксперимента взяли 11 ретронов (очевидно, вместе с их эффекторами) и вставили эти комплексы по одному в геном штамма E. coli, не имеющего никаких ретронов. Затем ученые стали заражать полученные варианты E. coli различными вирусами. Восемь вариантов показали высокую резистентность к вирусам: часть из них сработала против большинства вирусов, а часть проявила специфичную антивирусную устойчивость. Чтобы еще больше упрочить свое заключение о функции именно ретронной системы, ученые применили версию ретрона с мутацией в ретро-транскриптазе (то есть эффектор был нормальный, а у msДНК отсутствовала ДНК), а затем с мутацией в эффекторе (то есть эффектор был мутантный, а msДНК — нормальная). В обоих случаях инфекция убила штамм, защита оказалась недейственной. Вывод о защитной системе ретронов теперь выглядит надежнейше обоснованным.
Следующий поставленный вопрос: как работает эта защитная система? Авторы исследования, опираясь на известные функции некоторых эффекторов, предположили, что эта система тем или иным способом убивает зараженные клетки. В результате такого альтруистического самоубийства зараженная клетка сама погибает, но зато инфекция не передается клеткам-соседям. Это так называемая абортивная защита от инфекций (она хорошо изучена у растений).
Предположение об абортивной защите проверили опять же экспериментально. Штаммы с нормальным и мутантным ретронами заразили вирусом и посмотрели, как будет развиваться инфекция. В данном случае эффектором ретрона служил трансмембранный белок, нарушающий проницаемость клеточной мембраны. Когда он срабатывает, мембрана перестает выполнять свою функцию, и в клетку попадает все, что есть во внешней среде. Это позволило визуализировать процесс инфекции — в среду добавили флуоресцентный краситель, который в клетке приобретает красный цвет. После инфицирования вирусом клетки с мутантным ретроном стали красными через 45 минут, стенки разрушились, клетки растворились, вирусы вышли наружу — первый инфекционный цикл закончился. Клетки с нормальным ретроном покраснели уже через15 минут. При этом такие клетка погибали еще до завершения вирусного цикла, их стенки не растворились и вирусы не вышли наружу — в итоге заражение остановилось. Нужно подчеркнуть, что это лишь один из возможных способов самоубийства, ведь эффекторы у ретронов разные.
Действие одного из ретронов Ес48 (ретрон E. coli длиной 48 нуклеотидов) при заражении штаммов E. coli с нормальным ретроном (два верхних ряда) и мутантным ретроном (два нижних ряда). В среде имеется флуоресцентный краситель (пропидий йодид), который становится красным после попадания в клетку, то есть живые клетки черные, а мертвые красные. Вариант с нормальным ретроном уже через 15 минут окрашивается: клетка не успевает предоставить вирусу условия для размножения, а после смерти она остается целой. В клетки с мутантным ретроном краситель проникает лишь через 45 минут после заражения, клетка теряет целостность (краситель виден в среде вокруг клеток), вирусы выходят наружу. Рисунок из обсуждаемой статьи в Cell
Из этого вывода вытекает логично следующий вопрос: каков механизм запуска эффектора? Иными словами, что происходит между внедрением вируса и началом действия эффектора. Один из возможных посредников был найден. Им оказался белковый комплекс, имеющий наименование RecBCD. Это обязательный элемент у бактерий, так как он осуществляет репарацию ДНК, участвует во вставке новых фрагментов вирусных геномов в CRISPR-кассеты, а также является непременным участником всего остального противовирусного арсенала бактерии (в частности крошит на кусочки линейную двойную ДНК, ту самую, которую вирус впрыскивает в клетку). Так что неудивительно, что как противодействие бактериальной защите многие вирусы выработали специальные ингибиторы именно для комплекса RecBCD. Эти ингибиторы у разных вирусов разные, но их действие направлено именно на дезактивацию RecBCD.
В экспериментах с нормальными и мутантными RecBCD ученые продемонстрировали, что ретрон каким-то образом опознает, что RecBCD приведена в нерабочее состояние. И тут же активирует свой эффектор — значит, защита включена. Вероятно, процесс опознавания связан с присутствием одноцепочечной ДНК в химерной msДНК: именно с одним из ее участков умеет связываться RecBCD и с этим же сайтом связывается вирусный ингибитор, открепляя RecBCD от msДНК. Однако, как отмечают авторы, механизмы опознавания вирусной интервенции ретронами могут быть самыми разными и не обязательно сводятся к связи с RecBCD.
Ясно, что можно и дальше задавать вопросы, углублять эту тему, расширять ее, но это все же лишь одна статья. И без того она дала широчайший материал для осмысления. Где, как, при каких условиях включается врожденный иммунитет у бактерий? Почему здесь нужна такая странная химерная молекула? Как мы это можем применять ее (и можем ли) для наших медицинских задач? Все это, практически наверняка, темы ближайших будущих открытий. Я не побоюсь дать прогноз, что тема расшифровки работы ретронов станет не менее интересной и неожиданной, чем это было с системой CRISPR.
Источник: Adi Millman, Aude Bernheim, Avigail Stokar-Avihail, Taya Fedorenko, Maya Voichek, Azita Leavitt, Yaara Oppenheimer-Shaanan, Rotem Sorek. Bacterial Retrons Function In Anti-Phage Defense // Cell. 2020. DOI: 10.1016/j.cell.2020.09.065.
Елена Наймарк
