Ученые из ФИЦ ХФ РАН провели лазерную энуклеацию ооцитов человека и разработали методику лазерной энуклеации без предварительного флуоресцентного окрашивания. О своей недавно вышедшей публикации рассказывает с.н.с. ФИЦ ХФ РАН Алина Осыченко.
Для исследований и клинических задач бывают нужны ооциты, у которых нет ядерной ДНК – так называемый реципиентный цитопласт. Его получают путем энуклеации ооцитов, и далее используют для клонирования животных и для вспомогательных репродуктивных технологий человека. Традиционная методика подготовки реципиентного цитопласта – это аспирация метафазной пластинки при помощи микроиглы. При этом неизбежно теряются репрограммирующие факторы, содержащиеся в окрестностях метафазной пластинки. Поэтому развитие методики лазерной энуклеации, при которой нужный для развития биоматериал не теряется, имеет определенные перспективы.
Ранее и нами, и другими исследователями была показана возможность разрушения ДНК в ооцитах при использовании флуоресцентного окрашивания – ведь метафазная пластинка не различима в ооцитах при визуализации в проходящем свете. Однако для клинических задач применение флуоресцентного окрашивания неприемлемо, поэтому стояла задача добиться разрушения ДНК без использования красителей. Для этого необходимо решить две задачи: 1) найти альтернативный способ визуализации и 2) подобрать параметры лазерного воздействия.
Мы смогли визуализировать в поляризованном свете веретено деления клетки – это динамичная структура из тубулина, которая осуществляет деление клетки. Ориентируясь по расположению веретена деления, мы разрушали метафазную пластинку, которая расположена между двух полюсов веретена. Эффективность энуклеации без окрашивания варьировала от 40 до 100%, но этого было достаточно, чтобы заблокировать развитие ооцитов. При этом те ооциты, которые облучали в цитоплазму (не затрагивая метафазную пластинку) развивались на уровне контрольной группы. Это говорит о том, что лазерная энуклеация – эффективна, но само по себе лазерное воздействие – малоинвазивно.
При подготовке этой статьи у нас сломался самый главный прибор – фемтосекундный лазер Chameleon (Coherent, США). Поэтому нам пришлось срочно перестраиваться и работать на другом приборе – российском лазере TETA (Avesta), который работает на длине волны 1033 нм (на американском лазере мы работали на 800 нм). Нам удалось достаточно быстро подобрать параметры работы на новом приборе, а сам факт, что энуклеацию можно проводить при таких достаточно отличающихся параметрах (1033 нм vs 800 нм) говорит о воспроизводимости методики.
На ооцитах человека не удалось визуализировать веретено в поляризованном свете – они оказались более чувствительны к условиям, и перевозка ооцитов из клиники в лабораторию могла повлиять на их состояние. Тем не менее, при помощи дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) удалось обнаружить метафазную пластинку. Разрушение ДНК в ооцитах человека происходит принципиально так же, как и на ооцитах мыши. После ИКСИ (инъекции сперматозоида) энуклеированные ооциты человека не развивались.
