Ранее мы выяснили, что если вырезать нужный нам ген из ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции, получив липкие или тупые концы, той же рестриктазой обработать ту ДНК, в которую мы хотим этот фрагмент "засунуть", далее обработать все лигазами, то мы получим неплохую таки рекомбинантную молекулу ДНК. Остается теперь вопрос: а как эту ДНК поместить в нужную нам клетку. Давайте для простоты возьмем клетку бактерии.
Как перенести рекомбинантную ДНК в клетку?
Оказалось, что у бактерии есть два хранилища генетического материала: 1. Это ее кольцевая хромосома, она большая, плавает в цитоплазме и содержит всю основную информацию о строении и функциях клетки. 2. Плазмиды - это внехромосомные элементы ДНК, которые бактерии могут передавать друг другу. Эти самые плазмиды обеспечивают горизонтальный перенос генов (то есть ненаследственный перенос), в то время как кольцевая хромосома обеспечивает вертикальный (наследственный) перенос генов. Плазмиды очень инересны, так как они позволяют бактериям быстро распространить какие-то гены в популяции. Например, лечитесь вы антибиотиками, и решаете, что не будете пить весь курс, пару дней попили и хватит! А, действиетельно, зачем организм травить! В это время у вас в организме остались "недобитые" бактерии, они подверглись воздействию антибиотика, но выжили. Естественно, они эту способность передадут своим ближайшим "товарищам". Так и формируется антибиотикорезистентность. Кроме того, конечно, все не ограничивается выработкой устойчивости к антибиотикам, любое полезное свойство бактерии могут передать своим "товарищам" с помощью плазмид.
А что с переносом нужной нам ДНК? А все очень просто, вставляем интересующий нас ген в плазмиду по описанному выше методу, дело сделано, можно идти пить чай! Но, это еще не все...
Селекция трансформантов
Допустим, мы получили клетки, несущие нужные нам гены/ ген (этот процесс, кстати, называется трансформация, а сами клетки - трансформанты, не трансформеры!), а как понять, что именно эти клетки, которые перед нами несут нужные нам гены? А, может, плазмида вообще в них не перешла?
Для этого используют маркерный ген. То есть, нужный нам участок ДНК вставляем в плазмиду, в которой есть какой-то ген, дающий необычное свойство клетке. Например, таким маркерным геном может быть ген устойчивости к антибиотику ампициллину, при этом трансформированные клетки могут жить в среде с этим антибиотиком, в то время как все другие (нетрансформированные) гибнут.
А не возникнут ли проблемы с получением трансформантов?
Могут. Так как процесс перехода плазмид внутрь клетки это процесс сложный, только 1 из 1000 клеток трансформируется, но есть и хороший момент. Разработаны методы увеличения доли трансформантов. Хорошо зарекомендовал себя метод электропорации. Он заключается в шоковой обработке током суспензии клеток, при этом в клеточных стенках образуются поры, в которые может легко проходить плазмида. Также есть и другие методы, например, обработка детергентами, насыщенным раствором хлорида кальция. Так или иначе результат примерно такой же.
