Из-за пандемии коронавируса общественности пришлось познакомиться с основами вирусологии и столкнуться с волной новостей об заболевании. Часто приходилось встречать фразу «анализ производится методом ПЦР». Что это за метод и как он работает, зачастую, не упоминают. Что ж, давайте разбираться.
Метод «ПЦР» или «Полимеразной Цепной Реакции» позволяет многократно приумножить количество ДНК или РНК в пробе, чтобы определить её структуру, провести анализы или, как в случае с коронавирусом, проверить наличие вирусной ДНК/РНК в пробе.
Коронавирус принадлежит к семейству РНК-вирусов. Это значит, что информация внутри коронавируса записана в форме РНК. ПЦР для РНК проводится методом «обратного ПЦР», который является разновидностью классического ДНКового ПЦР. Для простоты понимания мы разберем метод для ДНК, так вы ощутите общую картину и лучше поймете смысл и принцип метода. С РНК технология похожа, но со своими нюансами, касаться которых мы не будем.
Итак, для начала вспомним как устроена ДНК. ДНК - молекула, состоящая из двух цепочек, идентичных друг другу, но лежащих антипараллельно (начало одной соответствует концу другой и наоборот). Каждая цепь состоит из азотистых оснований, соединенных между собой остатками дезоксирибозы и фосфатной группы. Вместе эти три компонента называются «Нуклеотид» и являются элементарной единицей ДНК. Встречается четыре азотистых основания Аденин, Гуанин, Цитозин и Тимин. Именно их последовательность и кодирует информацию в ДНК, подобно буквам в словах. Аденин в одной цепочке может соединяться только с Тимином из другой, а Цитозин только с Гуанином. Этот принцип называется «принципом комплементарности». Запомните этот термин, к нему мы еще вернемся.
Итак, школьную программу в памяти освежили, идем дальше. Первым этапом в проведении ПЦР является сбор и подготовка генетического материала. Для анализа ДНК человека или животного можно использовать почти все что угодно: волос, слюну, кусочек мяса и т.п. В случае с коронавирусом, наиболее простым и эффективным считается мазок из зева.
Когда мы получили генетический материал, нам нужно многократно приумножить количество возможной вирусной ДНК/РНК в пробе, так как её количество слишком мало для эффективного распознавания. К определенному количеству материала добавляется реакционная смесь, в которой содержится:
· DNTP (смесь нуклеотидов, тех самых кирпичиков, из которой будут строиться новые цепочки ДНК),
· Дистиллированая вода,
· ДНК-полимераза (фермент, который занимается постройкой новой цепочки ДНК),
· Буфер (стабилизирует смесь),
· Краситель (для последующей визуализации ДНК)
· Праймеры. Праймеры- короткие специфические участки синтезированной нами ДНК, служащие своеобразной затравкой для создания новой цепочки. Именно праймеры являются отправной точкой для полимеразы, с них будет начинаться строительство новой цепочки. Мы подбирает их индивидуально под тот участок ДНК, который хотим размножить.
Наконец, мы замешали реакционную смесь. Что же происходит с пробами дальше? Мы отправляем их в специализированный прибор-амплификатор. Амплификатор способен быстро разогревать и охлаждать содержимое пробирок до нужных температур. В нём и происходит вся магия. Разберемся конкретнее.
Весь процесс происходит в несколько этапов:
1) Начальная денатурация. На этом этапе ДНК под воздействием высокой температуры (95°С) распутывается и разделяется на 2 цепочки, освобождая место для работы праймеров и ферментов.
2) Денатурация. Этап, по методике и смыслу совпадающий с начальной денатурацией. Зачем он нужен второй раз-станет понятно позднее.
3) Отжиг праймеров. На этом этапе достигается оптимальная температура для работы праймеров. Она помогает им активироваться, найти свое место и сесть на цепочку ДНК.
4) Удлинение цепи. На этом этапе создается оптимальная температура для работы полимеразы. Время этого этапа подбирается в соответствии с длиной того участка ДНК, который мы хотим синтезировать.
5) Финальное удлинение. Последний этап, во время которого завершаются все цепочки, по каким-то причинам не успевшие достроиться.
После прохождения этапа 1 шаги 2-4 многократно повторяются (обычно 35-40 раз), тем самым увеличивая количество ДНК в двое с каждым новым циклом. Таким образом достигается концентрация ДНК, подходящая для дальнейшего анализа. Завершается все однократным этапом 5.
Что ж, мы извлекли пробы из амплификатора, но как же нам определить, присутствовал ли нужный нам фрагмент ДНК в пробе? В нашем случае, мы говорим о ДНК вируса. Для этого мы пользуемся методом гель-электрофореза.
В специальные кармашки в агарозном геле помещается некоторый объем нашей пробы. ДНК, под воздействием электрического поля, продвигается сквозь гель от катода к аноду, то есть от кармашков вниз. Чем длиннее синтезированная нами ДНК - тем сложнее ей «пропихнуться» через гель, а значит она окажется выше, чем более легкая.
После этого процесса мы, с помощью специального прибора, получаем изображение геля, с ярко выраженными «бэндами». Так называются полосочки, в виде которых наша масса ДНК мигрировала по гелю.
В случае с коронавирусом, если мы видим полосочку напротив кармашка с нашей пробой — значит в пробе содержалась ДНК вируса и человек болен.
Таким образом, метод, открытый в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом, стал одним из основных методов современной молекулярной биологии. Сегодня в наших руках сосредоточен мощный и точный инструмент, применяемый в науке и медицине всего мира. Этот метод позволяет нам оперативно выявлять коронавирусных больных и эффективно бороться с распространением одной из самых страшный эпидемий двадцать первого века.
