Продолжение
2. Материалы и методы
2.1. Материалы
Все материалы были приобретены у компании Sigma Chemical Co. (США) если не указано иное.
2.2. Модели и лечение животных
Всего в зооцентре Вэньчжоу медицинского университета (ВМУ, Китай) было приобретено 72 здоровых крысы линии Wistar (самка, масса тела 180-190 г). Уход за животными осуществлялся в соответствии с указаниями руководства по уходу и использованию лабораторных животных ВМУ. Это исследование было одобрено Комитетом по этике животных медицинского университета Вэньчжоу (утверждение № 2019-0773). По прибытии животных содержали в отдельных клеточных помещениях с контролируемой температурой (22 ± 2 °C), освещением (12-часовое/12-часовое светлое/темное) и влажностью. Всем подопытным животным бесплатно давали водопроводную воду и стандартный корм.
После адаптации в течение 1 недели крысы были разделены на четыре группы (n=18 в каждой группе): контрольная группа (кг); диабетическая группа (ДГ); диабетик с низкой мирицетиновой группой (ДГ-50, 50 мг/кг в сутки); диабетик с высокой мирицетиновой группой (ДГ-100, 100 мг/кг в сутки). Модели сахарного диабета и диабетического остеопороза животных были индуцированы методом инъекции СТЗ. Вкратце, чтобы вызвать инсулинорезистентность, крысам была предложена высокожирная диета (Диета #MD45%fat; Mediscience Ltd, Китай) в течение 4 недель. Для создания сахарного диабета II типа крысам внутрибрюшинно вводили СТЗ (35 мг / кг массы тела в 100 мл стерильного цитратного буфера, рН 4,5) в течение двух дней подряд. Уровень глюкозы в плазме крови был измерен через 72 ч после введения СТЗ, и крысы с произвольным уровнем глюкозы в крови выше порога 16,7 ммоль/л были признаны диабетическими и выбраны для дальнейших исследований. В исследовании было почти 15 или 16 крыс, оставшихся в каждой группе. Для дальнейших исследований мы включили по 15 крыс в каждую группу. Внутривенно глюкозу в крови тестировали еженедельно, чтобы убедиться, что уровень глюкозы в крови был выше 16,7 ммоль/л. После установления моделей всем крысам предлагали плацебо-контроль или мирицетин в течение 12 недель.
Крысам группы CG давали стандартный Чоу, а затем вводили только цитрат плацебо. Крысы в группе ДГ, ДГ-50, ДГ-100 были наведены впрыской СТЗ. Мирицетин был образован в 0,5% CMC-Na из-за его низкой растворимости в воде. Крысы в группах DG-100, DG-50 получали пероральный гаваж 50 мг и 100 мг мирицетина каждый день, в то время как группа CG получала пероральный гаваж 1 мл двойной дистиллированной воды (ddH2O) в 0,5% CMC-Na в течение 12 недель. Доза мирицетина была основана на предыдущем докладе ( Liao et al., 2017). Все крысы были убиты вывихом шейки матки через 12 недель. Образцы костей были получены от крыс и приготовлены с сохранением надкостницы. Для дальнейшего анализа, ddH 2 O-пропитанные Марли были использованы для обертывания каждой кости, а затем они хранились при температуре -20 ° C.
2.3. Биохимические анализы сыворотки крови
Перед жертвоприношением крысам вводили эфирную анестезию и получали кровь через пункцию сердца. Серологические концентрации кальция, фосфора и паратиреоидного гормона (ПТГ) определялись с помощью доступного набора для анализа (ZhongSheng Beikong Bio-technology and Science, China), в то время как концентрации остеокальцина плазмы и специфической для костей щелочной фосфатазы (ALP) определялись количественно с помощью наборов ELISA (CUSABIO, Wuhan, China) на основе инструкций производителя.
2.4. Морфометрия и микроархитектура костей
С помощью нониусных штангенциркулей регистрировали высоту, ширину и длину в качестве показателей морфометрии кости. Перед измерением проводили сушку костей при 110 °С в течение 48 ч, а затем их взвешивали. Длина бедренной кости определялась от большого вертела до медиального мыщелка, а ее ширина-от медиального мыщелка до латерального мыщелка. Наконец, для этого исследования измерялась высота бедренной кости от верха до дна латерального мыщелка.
Используя двухэнергетическую рентгеновскую абсорбциометрию (DXA), мы получили рентгенограммы костей иссеченной правой бедренной кости. С помощью микрокомпьютерной томографии (microCT) визуализировали микроархитектуру трабекулярной костной архитектуры на левом бедре (MicroCTm100, SCANCO Medical, Швейцария). Для анализа трабекулярной кости были выполнены сканы в пределах дистального метафиза бедренной кости и получено 100 изображений (14,8 мм / срез или 1,48 мм), которые были исследованы с полуавтоматически нарисованными контурами, начинающимися на расстоянии 50 срезов (740 мм) от ростовой пластины в пределах интересующего объема (VOI). Для получения изображения с разрешением 14,8 мм бедренные кости сканировали при 70 кв и 200 мА и времени экспозиции 300 мс. Затем для анализа восстановленных изображений было использовано программное обеспечение (Ray V4.0-4, Швейцария). Трабекулярное число (ТБ.N), трабекулярная сепарация (ТБ.Sp), объемная доля трабекулярной кости (BV / TV), индекс модели структуры (SMI) и толщина трабекулы (Tb.Th) по каждому образцу были проведены измерения, как сообщалось ранее ( Wedemeyer et al., 2007).
2.5. Гистологическое исследование
После жертвоприношения у каждой крысы собирали правые бедра, которые фиксировали в 4% (v/v) параформальдегиде, погружали в парафин, декальцинировали декальцинирующим раствором в течение одного месяца. Срезы тканей окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) по стандартной методике с последующим микроскопическим исследованием (Olympus, Япония).
2.6. Измерение уровня мочевого 8-гидрокси-2 дезоксигуанозина (8-Ohd) и антиоксидантной активности сыворотки крови
В этом исследовании уровень 8-Ohd в моче использовался для отражения окислительного повреждения. После лечения мирицетином в течение 12 недель мочу собирали каждые 24 ч с каждой крысы с помощью метаболических клеток и консервировали при температуре -20 °C. Затем с помощью набора ELISA (Uscnlife Life Sciences, Inc) измеряли мочевой уровень 8-Ohd. Активность СОД в сыворотке крови и активность каталазы определяли методом Kakkar (Kakkar et al., 1984) и метод колориметрии реагента дихромато-уксусной кислоты соответственно.
2.7. Статистическая оценка
Все данные были выражены в виде среднего ± S. D. анализ с помощью программного обеспечения SPSS version 18.0 был проведен для изучения сравнений между группами и статистическая значимость была проанализирована с использованием ANOVA. Значения с P
