Продолжение 4
2.10. Оценка уровня нитритов в грудной аорте
Внутриклеточный NO легко окисляется до нитрита (NO 2 – ) и нитрата (NO 3 – ), которые являются более стабильными соединениями. В отсутствие гемопротеинов производное L-аргинина NO самопроизвольно окисляется до нитрита в водных растворах. Таким образом, измерение нитрита является возможным методом для оценки уровней NO ( Green et al., 1982). Концентрацию нитритов определяли с помощью реактива Грисса ( Green et al., 1982). К 96-луночным микропластинкам добавляли 50 микролитров супернатантов грудной аорты, полученных описанным выше способом, а затем 50 мкл реактива Грисса. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре измеряли поглощение при 540 Нм с помощью спектрофотометра (Varioskan Flash, Thermo Scientific). Каждый образец анализировался в двух экземплярах. Результаты представлены в виде нитрита мкм на мг белка. Нитрит натрия был использован для построения стандартной опорной кривой.
2.11. Уровни белков и компонентов cGKI и NOS выше по NOS и ниже NPR-C в грудной аорте
Уровни белков cGKI, nNOS (NOS I), eNOS (NOS 3), AKT и ERK1/2 оценивали с помощью метода Western blotting. Уровни фосфорилированных форм, p-nNOS Ser-1417, p-eNOS Ser-1177 , p-iNOS Tyr-151 , p-AKT Ser-473 и p-ERK1 / 2 Thr-202 / Tyr-204, были также оценены. Гомогенаты грудной аорты, полученные из 10 мм сегмента аорты в 300 мкл буфера RIPA, дополненного коктейлем ингибиторов протеаз с помощью трубки для измельчения ткани со стеклянным пестиком, центрифугировали при 15 000 × g в течение 15 мин при 4 °C. общий белок измеряли в супернатанте с использованием реактива Брэдфорда и BSA в качестве стандарта. Использовали аликвоты по 100 мкг белка на лунку, за исключением cGKI, AKT, ERK1/2 и их фосфорилированных форм, для которых использовали 30 мкг белка на лунку. Белки nNOS, eNOS, iNOS, p-nNOS и p-eNOS были отделены с помощью 7,5% полиакриламидного гель-электрофореза и перенесены на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond ECL-G & E). cGKI, AKT, ERK1 / 2 и их фосфорилированные формы были отделены с помощью 12,5% полиакриламидного гель-электрофореза и перенесены на нитроцеллюлозную мембрану. После блокирования неспецифических сайтов связывания с 5% БСА, нитроцеллюлозные мембраны инкубируют при 4 °С с антителами против: нно (1:1,000), нноСер−1417 (1:1,000), ино (1:1,000), Р-ЕносСер−1177 (1:1,000), Р-иностир−151 (1: 1000), cGKI (1: 200), AKT( 1: 1000), p-AKT Ser-473 (1: 1000), ERK1 / 2 (1:1000), p-ERK1/2 Thr202 / Tyr204 (1:1000), и бета-актин (1:5000). После 3-х промывок мембраны инкубировали со следующими пероксидазно-конъюгированными вторичными антителами при комнатной температуре:кроличьим антикоз (1:4000), козьим антимозом (1:3000) и козьим антироликом (1: 3000). Иммуноблоты определяли с помощью усиленной хреновой пероксидазой / люминол хемилюминесцентной системы (Иммобилон Форте) с системой визуализации (Chemidoc Touch®, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Уровни всех белков были нормализованы до уровня конститутивного белка β-актина. Количественное определение полос иммуноблота проводили с помощью компьютерной программы ImageJ (RRID: SCR_003070 ).
2.12. Статистический анализ
Результаты были проанализированы с помощью программного обеспечения Prism версии 7.00 (GraphPad Software, RRID: SCR_002798, La Jolla, CA, USA). Непрерывные переменные оценивались на нормальность с помощью критерия Шапиро-Уилка. Различия в функции между 5 / 6Nx и фиктивными группами были проанализированы с помощью двухвостого непарного t-критерия Стьюдента. Влияние инфузии физиологического раствора или Нпцдк на среднее артериальное давление и частоту сердечных сокращений в группах оценивали с помощью парного критерия Стьюдента t тесты. Различия между группами были проанализированы с помощью двухсторонней ANOVA с последующим тестом множественных сравнений холма-Сидака, где одним фактором была обработка (физиологический раствор или NPCdc), а другим-группа животных (sham или 5/6Nx). При необходимости для статистического анализа использовалась односторонняя ANOVA с последующим тестом множественных сравнений холма-Сидака. Результаты представлены в виде средних ± стандартных ошибок средних (S. E. M.). Различия между группами считались значимыми при р
