Птичья скорлупа является одним из наиболее слабо используемых ресурсов в археологии и палеонтологии: она может предоставить ценную информацию об окружающей среде прошлого, поведении и взаимодействии человека с животными в ландшафте. Однако потенциал яичной скорлупы сдерживается сложностью идентификации видов птиц, к которым относится эта скорлупа. Традиционная идентификация основывается на размере (кривизна и толщина) и организации (оболочка, структура и организация пор), причем последняя требует подробного микроскопического обследования в дополнение к хорошей справочной коллекции. Морфологическое исследование занимает много времени и средств и подвержено влиянию тахометрии, которая разрушает и изменяет структуру оболочек.
Масс-спектрометрия MALDI-ToF (время десорбции лазером с матрицей) использовалась для идентификации белковых материалов с использованием таксономической специфики белковых последовательностей. Идентификация достигается путем расщепления белковых последовательностей ферментативно и сопоставления полученных пептидных масс с экспериментальными данными MALDIToF (включая de novo пептиды, полученные МС/МС). Когда это осуществляется на белках из организмов известных видов, это позволяет идентифицировать набор таксоноспецифических пептидных масс (м/з), т.е. маркеры, которые используются для идентификации археологических образцов. Впервые этот метод был применен для анализа кератинов волос археологического образца (одежды Ёци Ледяного человека) в 2008 г. Кератины также изучались на примере археологических рогов, тюков, волос и текстиля, но метод получил самое широкое применение в археологии с использованием более прочного и распространенного белкового коллагена, встречающегося в кости, зубах, пантах, слоновой кости, кожи и пергаменте.
Пептидные маркеры, установленные в этом исследовании, использовались для идентификации археологической скорлупы, обнаруженной в ходе недавних раскопок, проведенных Университетом археологических служб Лестера (УЛАС) на переулке Фришколы в Лестере (Великобритания). Археологические и исторические данные свидетельствуют о содержании и потреблении домашней птицы и дичи в средневековом Лестере, а также о промышленной деятельности, такой как обработка кожи, с учетом использования яиц в процессе обработки кожи. Таким образом, идентификация яичной скорлупы может дать возможность интерпретировать использование яиц в прошлом на объекте, будь то в качестве продуктов питания или в промышленной деятельности.
Материалы и методы.
Для создания "молекулярной" эталонной коллекции было использовано 62 образца (23 известных вида из 15 семейств и 13 порядков); учёные взяли 2 или более отдельных образцов яиц на таксон, где это возможно. Эталонная коллекция включает птиц, которые являются общими для археологических раскопок. Имеют археологическое значение для интерпретации использования ресурсов и земледелия или для которых были доступны геномы (страус, курица, утка, гусь, голубь, сокол, фулмар, будеригар, сычужная сова). Яйца Gallus gallus, Anas platyrhynchos, Coturnix coturnix и Anser anser были приобретены в местном супермаркете, а все остальные образцы были получены в Музее естественной истории (NHM-UK), где в настоящее время хранится более 1 000 000 000 яиц периода до принятия Закона об охране птиц. Некоторые из них зарезервированы в качестве конкретного источника хорошо каталогизированных и надежно идентифицированных (морфологически), но в остальном малоизвестных яичных скорлуп, пригодных для инвазивных и потенциально разрушительных исследований; это включает более 450 видов (содержащих более 90% гнездящихся птиц Британских островов).
Что касается археологических образцов, то для анализа было случайным образом отобрано 30 фрагментов яичной скорлупы с участка Фришколь Лейн, Лейчестер. Раскопки проводились УЛАС во время расширения торгового центра Ширас на запад и проходили в северо-восточном углу средневекового города. В средние века эта улица была бы недалеко от главной торговой улицы города и центром занятости и промышленности. Средневековый период на этом участке характеризуется тремя узкими участками с остатками деревянных каркасных зданий и связанными задними дворами с целым рядом карьеров, колодцев и подсобных помещений. Рассматриваемая скорлупа была обнаружена на самом дне одного из этих "промышленных" карьеров и датирована 1400-1500 гг. н.э.
Подготовка образцов.
Фрагменты яичной скорлупы очищали 0,5 М ЭДТА, промывали в сверхчистой воде и оставляли на воздухе для высушивания. После высыхания скорлупу измельчают до мелкого порошка (размером<500 мкм) и размельчают на сайте ∼30-35 мг для последующего анализа. Затем измельченную яичную скорлупу подвергали воздействию отбеливателя, 12% массы гипохлорита натрия (50 мкл отбеливателя на образец мгоф) в течение 100 ч для выделения внутрикристаллической фракции белков. Через 100 ч образцы промывали пять раз сверхчистой водой, кратковременно взвесившейся в метаноле класса ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), для удаления остатков хлорной извести и высушивали воздухом.
Образцы, высушенные воздухом, были разделены на два образца (∼17 мг каждый) для пищеварения трипсином ("Т" образцы) и эластазой ("Е" образцы). Для увеличения охвата последовательности белков ЖХ-МС/МС использовались два различных фермента, как видно из других археологических протеомных исследований. Археологическую скорлупу переваривали только трипсином. Каждая проба была полностью деминерализована в соляной кислоте 0,6 М при комнатной температуре, и растворы нейтрализованы. Нейтрализованные растворы сублимировали в течение ночи, и лиофилизат повторно суспендировали в 200 мкл бикарбоната аммония (Т-образцы) или 200 мкл 10 мкл трис-HCl (образцы "Е"). Затем пробы сокращались, алкилировались, переваривались и очищались.
В данном исследовании учёные определили набор значений 782 м/ц, потенциально полезных для идентификации яичной скорлупы в археологических раскопках.
К ним относятся значения 583 м/з, которые могут быть сопоставлены с последовательностями пептидов, полученными в результате углубленного протеомного анализа 62 образцов яичной скорлупы, принадлежащих 23 различным видам птиц. Увеличение числа геномов, находящихся в открытом доступе в хранилище NCBI, также позволило нам оценить частоту появления каждой пептидной последовательности в различных организмах, проводя поиск по базе данных последовательности белков в целом по системе BLAST. Этот анализ показал, что специфика большинства пептидов на самом деле ниже, чем ожидалось, что означает, что таксономическая идентификация может быть достигнута только на уровне семьи или выше. Это также указывает на любопытный факт, что биты "молекулярной машины", так или иначе вовлеченные в биоминерализацию, вероятно, имеют очень глубокое происхождение во времени. Заметными исключениями являются курица и голубь, которые можно с большей уверенностью идентифицировать по уровню родовой или даже видовой принадлежности.
