Материалы и методы
1. Экспериментальный дизайн и анализ биологических образцов
Эксперименты проводились на стандартной свиноферме. Экспериментальные процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Чжэцзянского университета. В общей сложности 84 поросят дюрок × ландрас × йоркширские поросята были взяты из 8 помётов, доставленных 8 многопарными свиноматками. Они размещались в стандартных условиях влажности около 70% и температуры 22 ± 2 °C. В ходе эксперимента свиноматкам разрешалось кормить поросят. Корм предоставлялся поросятам с 7 по 30 день. Свиньи были распределены в одну из следующих экспериментальных групп на основе массы тела: а) контрольные поросята не получали добавок железа; б) поросята внутримышечно вводились с 40 мг Fe/кг b.w. на третий день после родов и снова на 14 день; c) поросятам внутримышечно вводили 150 мг Fe/кг b.w. на третий день после родов. Железо вводили поросятам в виде FeDex. Мониторинг массы тела и выживаемости поросят проводился каждые 5 дней. Поросят приносили в жертву в возрасте 0, 10, 20 и 30 дней путем вдыхания CO2 и обескровливания для сбора тканей и крови. Образцы тканей замораживали в жидком азоте и держали при температуре -80 °C для анализа. Непосредственная пункция сердца была проведена сразу же после смерти для извлечения крови в гепаринизированную трубку. Для определения параметров эритроцитов и уровня сывороточного железа был использован автоматический анализатор SYSMEX F820. Содержание железа в печени и фрагментах двенадцатиперстной кишки определялось количественно с помощью наборов для анализа.
2. Изоляция РНК и количественная ПЦР
Общая РНК была выделена с использованием реагента TRIzol. кДНК была синтезирована с использованием обратной транскриптазы M-MLV. Количественная ПЦР в режиме реального времени была выполнена на базе системы ПЦР StepOne Real-Time в трех экземплярах.
3. Гистоморфологический анализ
Морфология двенадцатиперстной ткани наблюдалась при окраске гематоксилином и эозином (H&E). Двенадцатиперстная секция была зафиксирована на уровне 4% параформальдегида и внедрена в парафиновые блоки размером 5 мкм, которые затем окрашиваются H&E стандартными методами. Затем они были исследованы под микроскопом DM3000. Сканирующая электронная микроскопия использовалась для обнаружения морфологии микровили двенадцатиперстной кишки. Ткань двенадцатиперстной кишки фиксировали 2,5% глютаральдегидом, обезвоживали в градуированной серии этанола (30%∼100%) и переносили в смесь спирта и изоамилацетата (v:v = 1:1) на 30 мин и изоамилацетата на 1 ч. Затем в критическую точку Hitachi HCP-2 пробы обезвоживали жидким CO2. Обезвоженные образцы были покрыты палладием и визуализированы с помощью Philips SU8010 FASEM.
4. Прозрачная электронная микроскопия (ТЭМ)
Осаждение железа и аутофагия наблюдались на ТЭМ. Ткань печени фиксировалась, обезвоживалась и переносилась на чистый ацетон в течение 20 мин. Образцы помещали в смесь ацетона и смолы Spurr и переносили в смесь Spurr в течение ночи. Тканевые сечения помещали в капсулы, содержащие встраиваемые среды, нагревали до 70 °C в течение 9 ч, окрашивали ураниловым ацетатом и щелочным цитратом свинца в течение 15 мин и наблюдали при ТЭМ.
5. Иммунофлюоресценция РОС
Для иммунофлуоресценции печени использовались параформальдегид-фиксированные и парафин-встроенные участки. Ломтики толщиной 5 мм были обезжирены и увлажнены, после чего была проведена рециклинговая обработка Ag. Секции инкубировали в темноте в течение 30 мин с 3% диоксидом водорода. Ядра были окрашены DAPI.
6. Статистический анализ
Все измерения проводились, по крайней мере, в трех экземплярах, и данные были представлены в виде средней ± стандартной погрешности. Для статистического анализа использовалось статистическое программное обеспечение IBM SPSS. Разница между группами определялась Т-тестом Студента или, если их было более двух, ANOVA. P значение <0.05 считалось статистически значимым, а p значение <0.01 считалось чрезвычайно значимым.
Добавление щелевого железа увеличило массу тела поросят
Для оценки влияния различных стратегий добавления железа, сначала были изучены показатели роста и гематологические параметры. Поросята с железосодержащими добавками росли быстрее, чем поросята из контрольной группы без добавления железа в течение всего экспериментального периода. Вес поросят в группе Fe 40 + 40 был значительно (P <0,01) увеличен с 20 до 30 дней, что значительно выше, чем у поросят в группе Fe 150. Оценка гематологических параметров поросят ясно показала, что без добавления железа их гематологический статус постепенно ухудшался, что привело к появлению тяжелой формы АНД с 10 дня. Эффективному восстановлению гематологического статуса поросят способствовало применение железосодержащих добавок. Снижение дозы железа на поросят так же эффективно, как и однократная высокая доза, улучшило гематологические параметры до 10 дней. После второй инъекции FeDex значения всех показателей крови постепенно увеличивались.
