Материал и методы
1. Опухолевая модель
Самки мышей BALB/C (6-8 недель) были приобретены в Университете Янчжоу. Мышам вводили подкожно линию раковых клеток синтетической толстой кишки, клетки CT-26. Когда опухоли были видны, мыши BALB/C были разделены на две группы и лечились либо 250 мг/кг/кг/метформин мыши, либо таким же количеством нормального физраствора каждый день путем внутрибрюшинного введения. Объем опухоли рассчитывался как объем опухоли (мм3) = [длина опухоли (мм)×ширина опухоли (мм)2]/2 и измерялся каждые два дня.
2. Разделение МДСК
Как и в предыдущем эксперименте, из селезенки опухолевых мышей CT-26 выделяли муриновые МДСК с помощью изолирующего комплекта мыши. Чистота МДСК, полученных из изолированных клеток, была подтверждена методом проточной цитометрии.
3. Анализ проточной цитометрии (FCM)
Для поверхностных маркеров одноклеточные суспензии окрашивали соответствующим фторохромом; для внутриклеточного цитокинового окрашивания одноклеточные суспензии стимулировали иономицином, PMA, Monensin, Fzo Через 5 ч клетки окрашивали анти-CD3 и анти-CD8 mAbs или анти-CD4 mAbs, окрашивали PE-анти-MIFN-r в соответствии с инструкцией "Intracellular Stain Kit. Использованные флуоресцентные антитела включали PE-Cy5-анти-CD11b mAbs, PE-Cy5-анти-CD3 mAbs, PE-анти-Gr-1 mAbs, PE-Ly-6 G mAbs, PE-анти-IFN-γ mAbs, FITC-Ly-6C mAbs, FITC-анти-CD4 mAbs-CD и FITC. Все антитела были куплены в eBioscience, Сан-Диего, Калифорния. Окислительно-чувствительный краситель 2,7-дихлорфтористый диацетат был получен из Invitrogen, Carlsbad, CA.
4. Обнаружение аргиназной активности
Активность аргиназы определялась с помощью количественного колориметрического анализа с использованием набора QuantiChrom Arginase Assay.
5. Анализ на подавление Т-клеток
В эксперименте vitro G-MDSCs, выделенные из селезенок опухолевых мышей CT-26, культивировали с метформином или без него в течение 2 ч. Клетки подвергали предварительной обработке в течение 1 ч препаратом С или DMSO, а затем все препараты выводили. В эксперименте in vivo G-MDSCs, выделенные из селезенок опухолевых мышей, лечили метформином или нет. CD4+ Т-клетки были выделены из селезенок мышей дикого типа BALB/C и промаркированы 1 мкМ CFSE в PBS в течение 10 минут при температуре 37 ℃. Для активации клеток CD4+T использовалось моноклональное антитело анти-CD3 и анти-CD28mAb. CD4 + Т-клетки были выращены совместно с G-MDSCs в течение 48 ч при температуре 37 ℃. На 2-й день клетки были окрашены PE-Cy5-анти-CD4 mAbs и проанализированы на интенсивность CFSE проточной цитометрией для измерения пролиферации CD4+T-клеток.
6. Западная промокашка
G-MDSCs, отобранные MACS из селезеночных клеток опухолевых мышей CT-26 BALB/C, и собранные после лечения в соответствии с различными экспериментальными требованиями. GM-CSF был использован для улучшения выживаемости и активности G-MDSCs изолированных от мышей. Лизат RIPA добавляли и помещали на лед в течение 30 минут, в течение которых клетки встряхивали каждые 10 минут, центрифугировали при 4 ℃ в течение 12.000 г в течение 15 минут, а верхнюю жидкость поглощали для определения концентрации белка. В соответствии с пропорцией, 5 × SDS-PAGE буфер был добавлен в образцы белка, и образцы хранились при температуре -20 ℃ в течение 10 минут в кипящей водяной бане. Белки отделяются SDS-PAGE и переносятся на мембраны PVDF. Мембрану PVDF замочили в TBST, содержащую 5% BSA, а затем герметизировали при комнатной температуре в течение 1 часа на шейкере. Для связывания с белками у CST были закуплены антитела кролика фосфо-AMPK-1α, кролика фосфо-STAT3, кролика AMPK-1α и кролика STAT3. Анти-кролик-HRP был использован в качестве вторичного Ab. Иммунореактивные белки визуализировались методом хемилюминесцентного обнаружения. Для белков, используемых для второго воздействия, промывайте их с помощью моющего раствора ТБСТ в течение 3 раз, каждый раз в течение 10 минут, а затем промывайте с помощью пробы Вестернблот Стриппер Буфера в течение 1 часа при 37 ℃, перемывайте их моющим раствором ТБСТ в течение 3 раз каждые 10 минут, выдерживайте первичные антитела и вторичные антитела, а затем подвергайте повторному воздействию.
7. Статистический анализ
Данные представлены в виде среднего значения ± SD. Полученные данные были подвергнуты тестированию студентом с помощью программы SPSS 19.0. Существенными были признаны расхождения с уровнем Р менее 0,05.
Лечение метформином замедляет рост опухолей у опухолевых мышей
Метформин играет лечебную роль во многих типах опухолей. Для подтверждения того, оказывает ли метформин ингибирующее действие на опухолевой рост при раке толстой кишки, мышам BALB/C были имплантированы 2 × 105 клеток CT-26. Метформин значительно тормозил рост опухоли по сравнению с контрольной группой. Масса опухоли метформин-обработанной группы. В соответствии с этим выводом, объем опухоли в метформин-обработанной группе был также значительно меньше, чем в контрольной группе. Это позволяет предположить, что метформин может замедлить опухолевое прогрессирование опухолевых мышей CT-26.
