Когда вы подготовили пробы к ПЦР, то надо их поставить в ПЦР машинку и запустить амплификацию. Чтобы это сделать, надо знать, каким протоколом следует пользоваться. У реакции ПЦР три основные фазы: (1) денатурация - нити ДНК расходятся, становятся одноцепочечными, чтобы на них могли сесть праймеры, (2) отжиг - присоединение праймеры, (3) элонгация - процесс наращивания цепи, то есть именно на этой фазе работает Taq-полимераза, присоединяя к растущей цепи нуклеотиды.
На этой картинке изображено то, что происходит в пробирке во время ПЦР.
А эта картинка представляет собой уже графическое изображение протокола, который надо задать ПЦР машинке. Обычно он так и выглядит на экране машинки, и вы можете менять время, температуры и количество циклов. Также можно изменить количество шагов.
Шаг 1. - Это начальная денатурация. Обычно ее ставят 1-5 минут, в среднем 2-3 минуты.
Шаг 2. Фаза повторяющихся стадий денатурация-отжиг-элонгация. Этот шаг зациклен, и должен повторяться 30-35 раз. Именно на этом шаге происходит многкратное копирование ДНК. Время выставляется по-разному, это зависит от качества ДНК и длины фрагментов. Цикл, которым пользуюсь я: 30 сек - 45 сек - 1 мин. Я удлиняю фазу отжига до 45 сек, потому что в моем случае качество ДНК обычно не очень хорошее, и я даю праймерам больше времени, чтобы к ней прицепиться. Однако я рискую тем, что праймеры сядут на что-то еще, кроме моего целевого фрагмента. Если у вас хорошее качество ДНК, то есть смысл укоротить фазу отжига, чтобы продукт был почище.
Шаг 3. Финальная элонгация, для того, чтобы как можно больше участков нужного фрагменты нарастили длину, обычно ее выставляют на 5-10 минут. Я обычно ставлю на 10 минут.
Ну и в конце обычно машинку просят опустить температуру до 4 градусов. Если вы не сможете сразу же забрать пробы, они будут храниться охлажденными.
Обычно реакция ПЦР занимает 2-2.5 часа.
Температура отжига - это ключевой фактор во всей этой схеме, и она может варьировать от 40 до 70С. Если вы ее выставили неправильно, то даже при наличии ДНК хорошего качества и работающих праймерах, у вас может быть низкий выход продукта или его не будет вообще. Эта температура зависит от множества факторов, и про это у меня есть отдельная статья. Обычно рекомендуются температуры > 50С, потому что чем ниже температура, тем больше риск, что праймер сядет на что-то еще, кроме нужного участка ДНК. Но я все равно часто использую низкие температуры для отжига, потому что некоторые праймеры работают только так.
Остальные температуры в основном более или менее стандартные. Температуру денатурации можно немного варьировать, обычно она 94-95С. Температура элонгации обычно 68-75С, в зависимости от температуры отжига. Я ставлю температуру элонгации пониже, если у меня температура отжига < 50С. Эти изменения могут помочь для тонкой настройки, чтобы увеличить выход продукта.
Еще полезно знать о step-up и step-down протоколах.
При Step-up (touch-up) протоколе 5 первых циклов запускают при более низкой температуре. Это полезно, если у вас праймеры не очень специфичные. При более низких температурах у них больше шансов прицепиться к ДНК. Поэтому первые 5 повторений они работают при более низкой температуре, а после этого 30-35 повторений они работают при своей более подходящей температуре. Таким образом, вышеприведенная схема удлиняется на один шаг. Шаг 2 - цикл, повторяющийся 5 раз, при низкой температуре (например, 50С), шаг 3 - цикл, повторяющийся 30-35 раз при более высокой температуре (например, 55С), ну и потом все так же.
Step-down (touch-down) протокол. Может использоваться, если у вас оптимальная температура праймера низкая, и есть риск того, что будет большой процент неспецифичного продукта (чего-то, что вам не надо). Для того, чтобы этот эффект минимизировать, на шаге 2 ставится цикл из пяти повторений при более высокой температура отжига (например, 50С), а потом на шаге 3 - ставится цикл из 30-35 повторений с температурой более низкой, но оптимальной для праймера (например, 45С). Таким образом, во время первых пяти циклов больше шансов, что амплифицируется нужный фрагмент, а не что-то еще. Когда температура опустится, праймеры с большей вероятностью будут сажаться на нужный фрагмент, потому что его будет уже довольно много в пробирке.