Из-за пандемии коронавируса многие из нас не один раз пользовалась дарами иммунологии — то есть сдавали тест на ковид. Вместе с «Авивир» рассказываем, как мы пришли от небезопасного радиоиммунного анализа к домашним экспресс-тестам, которые дают результат за 2 минуты.
Своим появлением вся группа ковидных тестов, кроме стоящего особняком ПЦР, у которого совершенно иной принцип работы, обязана бурному развитию иммунологии во второй половине ХХ века. Именно тогда были разработаны основные методы работы с антителами и намечены основные пути их использования в медицине.
В 1950-х годах уже было известно, что в нашем организме антитела вырабатываются B-лимфоцитами в ответ на появление чужеродных частиц-антигенов, умеют их узнавать и приклеиваются с невероятной избирательностью, делая заметными для остальной иммунной системы. Выяснилось также, что в качестве антигенов может выступать практически любая субстанция — бактериальные белки, чужеродные гормоны и даже антитела из других видов животных. Та же задача — найти в биоматериале конкретное вещество и пометить его — постоянно встречается в лабораторной практике. Сочетание специфичности и универсальности делало антитела отличными кандидатами на роль идеального маркера.
Первые шаги к лабораторному применению антител были сделаны в середине ХХ века, когда появился радиоиммунный анализ. Для выполнения этого теста требовались неразмеченный образец, некоторое количество искомого вещества, помеченного радиоактивной меткой, и антитела к нему. Все это смешивалось друг с другом, а затем антитела с приклеившимся к ним антигеном отделяли от общей взвеси. Если во взвеси оставалось много меток, это означало, что большинство антител «занято» веществом из образца. И наоборот, если вся радиоактивная метка уходила в антитела, это значило, что в образце нет ничего, что могло бы связаться с антителами.
Метод оказался очень точным и невероятно ценным — позже исследователям дали за него Нобелевскую премию. Тем не менее, использование радиоактивной метки было опасным для здоровья, и ей пришлось искать замену. Сделать это удалось в начале 1970-х: две независимые группы шведских и голландских ученых предложили использовать для этого цветные ферментативные реакции.
Сигнальные ферменты
Некоторые ферменты катализируют реакции, в которых их субстрат меняет цвет. Именно такие ферменты исследователи и решили пришить к антителам. Одним хвостом такой гибрид должен «узнавать» закрепленный на целлюлозе антиген, а другим — после добавления ферментативного субстрата — сигнализировать о своем присутствии ученым. Не связавшиеся с антигеном гибриды можно было просто смыть, чтобы сигнал от них не поступал.
Шведская версия иммуноферментного анализа (ИФА) — так назвали новую технологию — была сделана для поиска кроличьих иммуноглобулинов. Вообще-то, иммуноглобулины — это и есть антитела. Но если вакцинировать ими другое животное, например овцу, они могут выступать и в роли антигенов. Овечий иммунитет будет считать кроличьи иммуноглобулины инородными и подберет собственные антитела, которые будут ловить только иммуноглобулины кроликов и больше ничего.
Имея на руках кроличьи иммуноглобулины и овечьи антитела, ученые сконструировали сам тест. Овечьи антитела закрепили на целлюлозе, а к кроличьим пришили щелочную фосфатазу, которая умела перерабатывать бесцветный субстрат в продукт желтого цвета. К тому моменту все подготовительные стадии (сшивка с ферментом, иммобилизация антител) уже были опубликованы. Исследователям оставалось лишь собрать все воедино и удостовериться, что из-за сшивки ни фермент, ни антитело не утратили своих функций.
Несмотря на то что дееспособность таких гибридов подвергалась сомнению, они отлично сработали. Сшитые с фосфатазой кроличьи иммуноглобулины цеплялись за овечьи, закрепленные на целлюлозе, и потом при добавлении ферментативного субстрата меняли его цвет.
Голландцы сделали практически то же самое, но взяли вместо фосфатазы пероксидазу хрена, а на роль искомого антигена выбрали хорионический гонадотропный гормон человека (ХГЧ). Кроме того, в своей статье они крайне лаконично описали практическое значение работы, упомянув лишь, что тест можно проводить на образцах мочи. На деле это означало, что придуманная ими реакция может быть использована в тестах на беременность.
На момент разработки ИФА тот факт, что концентрации ХГЧ в моче сильно вырастают в первые недели беременности, был широко известен и вовсю использовался для анализов на беременность. В состав наборов входили две емкости: в одной находились клетки овечьей крови, покрытые ХГЧ, а в другой — антитела на этот гормон. Содержимое смешивалось, туда добавлялась моча, и все это выдерживалось в течение нескольких часов. Если в моче был высокий уровень ХГЧ, то все антитела прилипали к нему, и клетки крови оставались плавать в прежнем состоянии. Но если ХГЧ не было, антитела концентрировали свои усилия на клетках крови, и спустя пару часов они все оказывались слеплены между собой. Присутствие сгустков говорило о том, что женщина не беременна. Появление таких тестов, особенно их версии для домашнего использования, являлось невероятным прогрессом, но до современных тестов, дающих результат за две минуты, им было очень далеко.
Проще, быстрее, доступнее
Технология, придуманная голландцами, не подразумевала домашнего использования, но обладала рядом преимуществ. Например, она не требовала присутствия цельных клеток и давала быстрый количественный, а не качественный результат. Детекция результата по цвету раствора оказалась проще и могла быть автоматизирована.
ИФА оказался настолько перспективным, что «допиливать» эту технологию и искать ей применение кинулись многие. Буквально за десять лет она стала одной из самых востребованных в иммунологии. Параллельно с ней появились и другие методы, которые существенно упростили ее применение.
Прежде всего, в обиход исследователей вошли полистирольные микропланшеты. Свойство белков (и, в частности, иммуноглобулинов) цепляться к поверхности полистирола и его модификаций было открыто в 1960-е годы, а появление планшетов с 96 лунками для анализов позволило упростить и частично автоматизировать методику.
Дополнительный толчок к развитию ИФА-методов дал метод, позволяющий воспроизводить антитела с заданными свойствами. Придумывать и конструировать антитело к конкретному антигену, будь то ХГЧ или спайк-белок коронавируса, ученым не обязательно — для этого можно воспользоваться услугами иммунитета. Если вколоть антиген кролику или другому животному, спустя некоторое время у них в селезенке начнут вырабатываться В-лимфоциты, производящие антитела с требуемой специфичностью. Но эти клетки не могут делиться вечно, поэтому наработать большое количество одинаковых антител таким образом не получится.
Поставить на поток производство абсолютно одинаковых антител позволил метод гибридом, за который его открывателям присудили Нобелевскую премию. Суть метода заключается в получении гибридов двух сортов клеток: производящих антитела и плохо делящихся В-лимфоцитов, а также клеток миеломы, которые отлично умеют размножаться, но не умеют производить антитела. Получившиеся клетки проверяют на то, что они действительно могут нормально размножаться, производят антитела — причем антитела к нужному антигену. Клетку, которая делает самые лучшие антитела, оставляют. На ее основе запускается их производство. С появлением этой техники возможности исследователей расширились, и до сих пор эта технология — одна из ключевых в иммунологии.
Модификации ИФА позволили сильно упростить само тестирование. Одним из тормозящих звеньев была необходимость придумывать для каждого нового антигена сшивку с ферментом. Кроме того, для каждого нового образца приходилось этот фермент пришивать заново и тратить на это время. Чтобы избавиться от этой необходимости, был придуман так называемый «сэндвич ИФА», где антиген зажимается между двумя специфичными к нему антителами. Первое удерживает всю конструкцию на поверхности, а второе служит посадочной площадкой для универсального «красящего» антитела с пришитым ферментом. Благодаря этому подготовка эксперимента для совершенно нового антигена свелась к получению из животных специфичных антител, а для окраски можно было использовать универсальные антитела с ферментом. Кроме того, эта вариация оказалась точнее и позволила обнаруживать даже небольшие концентрации антигена.
Такой вариант ИФА позволяет аккуратно определить количество нужного вещества в образце за сравнительно короткое время. Если же искомое вещество само по себе является антителом, то схема меняется в соответствии с запросом: теперь уже антитела ловят на приманку из антигенов. Именно такой вариант используется, когда нужно определить уровень антител к конкретному белку коронавируса. Он выполняется в лаборатории и требует времени.
Работа на скорость
Но часто важными оказываются не количественные подсчеты, а скорость — как, например в случае с тестом на беременность или экспресс-тестами на ковид. Как уже говорилось, первые ИФА-тесты предназначались совсем не для домашнего применения. Потребовалось полтора десятка лет, чтобы привести их к привычному виду полосок, готовых выдать результат за несколько минут.
Проточная организация этих тестов позволила уйти от бесконечных промываний лунок: благодаря адсорбционным свойствам наполнителя молекулы антигенов протекают из одного конца полоски в другой по очереди, встречаясь с разложенными реагентами и цепляя их на себя.
Вместо ферментативной реакции сейчас часто используют другие красители, например кусочки латекса или золотые наночастицы. Однако суть теста от этого не меняется. Если перепутать и добавить образец с другой стороны полоски, тест не сработает — гибридные антитела будут двигаться в противоположном направлении. В этом случае тест не покажет ни положительной, ни контрольной полосы.
А это точно?
Точность теста сильно зависит от того, как именно подобрана пара антиген — гибридное антитело. В случае ХГЧ найти оптимальные антитела легко, ведь ХГЧ у всех одинаковый. Но если это тест на коронавирус со множеством штаммов, задача становится нетривиальной.
В этом случае разработчики стараются подобрать антитела с наиболее широким покрытием, узнающие самые консервативные участки белков. В то же время выбранные антитела должны игнорировать белки сезонных коронавирусов, которые в противном случае дают ложноположительный результат. Способность антител узнавать разные штаммы варьируется от производителя к производителю — это значит, что и результаты тестов могут оказаться не консистентны.
Обратный экспресс-тест, тест на антитела, имеет все те же проблемы с балансом точности, а также дополнительные нюансы. Использовать его имеет смысл в ситуациях, когда нужно быстро распознать позднюю стадию ковида или удостовериться, что человек болел или прививался. При позднем ковиде организм вырабатывает антитела класса IgM, а во время выздоровления и после него — антитела класса IgG. Продвинутые экспресс-тесты улавливают эту разницу.
В качестве крючка-антигена, на который будут ловиться антитела, обычно берут RBD — домен спайк-белка. Это не самый консервативный участок вируса, но антитела, которые на него ловятся, особенно важны для борьбы с ковидом. Блокируя этот домен, они препятствуют попаданию вируса в клетку и тем самым нейтрализуют его. Строго говоря, способность антител к нейтрализации нужно каждый раз проверять в отдельном эксперименте, но в целом антитела именно к этому домену имеют больше всего шансов помешать вирусу заразить клетку.
Но не всем разработчикам удается подобрать нужные параметры для тестов. Так, например FDA предостерегает от использования экспресс-тестов на коронавирус Lepu Medical Technology и антительных тестов Leccurate — слишком много они выдают ложных результатов.
Сравнение результатов семи коммерческих тестов на коронавирус показало, что в зависимости от концентрации коронавирусных белков в образце они ловят их с разной чувствительностью. В исследовании участвовали обычные больные без секвенирования вируса, так что мы не можем узнать, какие именно штаммы были целью проверки. Если некоторые образцы без проблем узнавались практически всеми тестами, то с другими срабатывали не все.
Возможно, дело как раз в специфичности тестов к разным вариантам вируса. Например, для теста RapiGEN потребовались концентрации примерно в 1000 раз больше, чем для других тестов. Некоторое время назад озвучивались сомнения в том, что подобные тесты не реагируют на сезонные коронавирусы. В этом исследовании оказалось, что все семь достаточно специфичны. Поэтому беспокоиться о том, что результаты окажутся ложноположительными, по крайней мере для этих тестов, не стоит.
Вера Мухина
