Здравствуй читатель, эту статью я хочу посветить ещё одной связанной с вирусами теме ПЦР. Я постараюсь объяснить, что такое ПЦР и как эта штука работает.
Идея написать о данном виде исследований (а это именно метод исследований) у меня появилась после общения с некоторым количеством людей, для которых данное буквосочетание является непонятным, а в свете нынешних событий ещё и ругательством.
Пару слов о себе: в бывшем аспирант ВНИВИПа по специальности ветеринарная вирусология, микробиология, иммунология.
Это довольно сложная для объяснения тема и я боюсь, что без занудства мне не обойтись. Поэтому заранее прошу прощения и честно не ожидаю большого количества просмотров этой статьи.
Итак начнем, изначально необходимо понять, что такое ДНК, ведь именно эта молекула и является объектом исследования в данной реакции. Я взял в качестве примера ДНК, но не имеет значение какая из нуклеиновых кислот принимает участие в реакции.
По простому ДНК это молекула которая в действительности хранит информацию о организме в котором она находиться. Структурно она состоит из двух нитей ориентированных в пространстве в виде спирали (картинка в начале статьи). А вот дальше много сложней, но необходимо для понимания работы ПЦР.
Сама спираль молекулы (как видно на верхнем рисунке) состоит из двух спиральных направляющих (сахарофосфатный остов) а промеж них перемычки нуклеиновых оснований аденин (далее - А), гуанин (Г) и три пиримидиновых цитозин (Ц), тимин (Т). Эти основания могут соединяться между собой водородными связями по принципу комплементарности А-Т, Г-Ц схематично это выглядит следующим образом.
А при необходимости произвести белок, спираль эта подвергается денатурации, иными словами распускается на две нитки и при помощи фермента РНК-полимеразы синтезирует РНК, а при необходимости сделать копию себя, используется фермент ДНК-полимераза.
Так вот для того, что-бы запустить процесс удвоения ДНК (репликации) в ядре клетки должны находиться сама молекула ДНК, ДНК-полимераза ну и строительный материал для новой молекулы это перечисленные выше основания А, Г, Т, Ц. Схематично этот процесс выглядит так.
Именно таким образом и производиться новая ДНК внутри нашего организма. Процесс этот не сложный, но человечество прошло довольный путь перед его открытием.
Естественно после открытия этого процесса, возник вопрос, а как повторить данную картину вне клетки in vitro (т.е. в пробирке). И вот впервые в 1985 появляется публикация R. Saiki с соавторами, который описывает удачный процесс репликации ДНК. Реакция которая происходила в этот момент в пробирке называется Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР).
Заслуги людей которые разработали данный метод сложно переоценить, Этот метод открыл новые возможности в диагностике болезней и исследовательской деятельности. Но прорывом, позволившим сделать ПЦР действительно удобной в постановке, стало использование термостабильной ДНК-полимеразы, которая может выдерживать многократный нагрев до 90 градусов.
Давайте разберёмся зачем здесь что-то греть? Ведь в клетке происходит аналогичная реакция и не что не нагревается до таких температур. Всё как всегда просто, для развертывания нитей ДНК без всяких ферментов, нам её проще всего нагреть (90-100 градусов) и тем самым вызывать денатурацию, после чего мы должны присоединить праймеры и снизить температуру до 55-65 градусов и потом для комплементарной реакции достройки новых нитей ДНК поддерживать температуру 72 градуса.
У нас появился новый термин праймер, что это за зверь? Праймер кодирует начало и конец синтеза необходимого нам участка ДНК. Это небольшие цепочки ДНК, которые когда присоединяются к материнской ДНК, указывают полимеразе откуда начать синтез. А как подбирают эти праймеры, для этого имеется специальная программа которая находит участки ДНК подвергающиеся наименьшим изменениям в процессе размножения вируса, бактерии или многоклеточного организма.
Вот картинка которая наглядно показывает процесс реакции ПЦР., которую я взял из практикума ветеринарной вирусологии авторы Р.В. Белоусова, Н.И. Проценко, Э.А. Преображенская.
Не вникая в сложные нюансы, суть реакции заключается в повторении искомого участка НДК или РНК в геометрической прогрессии.
Таких обозначенных на схеме циклов можно было бы повторять бесконечное количество раз, если бы конечно не было несколько но.
У нас в системе ограниченное количество оснований А, Г, Ц, Т.
Ограниченное количество праймеров (которые то же тратятся в процессе реакции)
И нарастающего температурного повреждения полимеразы.
Поэтому число циклов ограничено и экспоненциальный характер реакция носит только до 20-25 цикла, а уже на 40-45 цикле реакция выходит на плато.
Расшифровка результатов ПЦР производиться различными способами это электрофорез, гибридизация меченных генов, флуорометрия, радиоизотопы и пр.
Сама реакция не только позволяет определить геном, но ток же внести в него изменения и это даёт много возможностей генной инженерии, молекулярной биологии. С помощью этого метода устанавливают родственников и помогают установке личности преступников. Применение его в исследовательской деятельности дает такие преимущества как ускорение работы исследователя, а так же позволяет повысить их точность.
Но всё это было бы хорошо если не пару но. Реакция проста для постановки, но требует точности в установлении праймера, это важно, так как на выходе мы смотрим сколько расплодилось участков ДНК в результате реакции в количественном выражении, правильность их синтеза мы определить не сможем. Еще подводным камнем для врача является понимание на сколько важно выявление возбудитель, ведь бывают ситуации когда выявленный возбудитель может не давать симптомов, к примеру его количество в организме крайне мало, а лаборанту просто повезло нарваться, реакция всё равно покажет, что увидело это ДНК.
А ещё эта реакция применяется при анализе фальсификации продуктов питания, ну скажем посмотреть не заявленное в составе мясо. Тут совсем другая проблема даже маленькие часть постороннего ПЦР может показать, иными словами незначительные следы, сказать однозначно, что данный продукт фальсифицирован или содержит незначительные следы постороннего, достаточно сложно.
Как видно сложность возникает не в постановке нового метода исследования, а его интерпретации.
Статья подготовлена при помощи материалов взятых из "Практикума ветеринарной вирусологии" авторы Р.В. Белоусова, Н.И. Проценко, Э.А. Преображенская.
К стати говоря а вы читатель сможете привести ещё примеры человеческой деятельности где еще можно использовать ПЦР?
Если статья вам понравилась, то ставьте лайки, оставляйте комментарии.
