Постепенные улучшения в результатах ЭКО являются следствием сочетания модернизации сред, методов и оборудования. Исследования влияния условий окружающей среды на развитие эмбрионов способствовали значительному прогрессу в технологии инкубаторов, поддерживающих ключевые условия, такие как температура во время культивирования эмбрионов (Fujiwara et al., 2007; Swain, 2014).
В то время как внимание было сосредоточено на улучшении процедур и оборудования в эмбриологической лаборатории, меньший интерес проявлялся к процессам переноса клеток между женщиной и лабораторией. Недавние исследования продемонстрировали колебания температуры при переносе эмбрионов (Macklon et al., 2021). Аналогичная проблема возникает при пункции ооцитов с использованием современной технологии, состоящей из вакуумного насоса, пробирок и нагревательного блока. Несмотря на то, что пробирки предварительно прогреваются до 37°С, температура фолликулярной жидкости, содержащей кумулюсно-ооцитарный комплекс (ОКК), может снизиться на 6,4°С во время забора ооцитов (Redding et al., 2006). Мало что известно о клинических последствиях колебаний температуры во время извлечения ооцитов, хотя ооциты чувствительны к колебаниям температуры. Температура влияет на многочисленные физиологические функции и важна для поддержания гомеостаза. Повреждение веретена наблюдалось при воздействии на ооциты пониженных температур (Almeida and Bolton, 1995; Aman and Parks, 1994; Pickering and Johnson, 1987; Pickering et al., 1990; Sathananthan et al., 1988; Zenzes et al., 2001), за счет деполимеризации микротрубочек (Magistrini and Szöllösi, 1980). Было показано, что даже незначительное охлаждающее воздействие 3 °C разрушает веретено ооцита, что приводит к значительному снижению частоты оплодотворения и клинической беременности (Wang et al., 2001, 2002). Повышение температуры более 39°C приводят к необратимому повреждению веретена (Sun et al., 2004).
Чтобы исследовать изменение температуры во время обычной практики пункции с использованием технологии пробирки и помпы, были проведены имитационные процедуры извлечения ооцитов. Результаты показали, что падение температуры может быть частично связано с потерей скрытой теплоты испарения при переливании фолликулярной жидкости из пробирки в чашку Петри, при этом все пробирки и чашка были предварительно нагреты и чашка находилась на нагревательном столике.
Для решения этой проблемы были исследованы возможные причины потери тепла, и было разработано новое устройство под названием Eggcell, которое обеспечивало бы температурную стабильность от аспирации фолликулярной жидкости в процедурном кабинете до определения ОКК в лаборатории. Данное исследование направлено на изучение эффективности устройства
Дизайн Eggcell
Eggcell была разработана в несколько итерационных этапов с эмбриологами, клиницистами или инженерами-конструкторами, которые тестировали и давали отзывы для дальнейшего пересмотра конструкции. В качестве критичных критериев были определены следующие:
- Фолликулярная жидкость не должна контактировать с воздухом во время сбора ооцитов, чтобы поддерживать стабильную температуру.
- Должна поддерживаться физиологическая температура.
- Система должна быть совместима с текущими операционными и эмбриологическими процедурами.
- Материалы компонентов должны быть пригодны для клинической эмбриологии.
- Процессы проектирования и разработки должны быть совместимы с массовым производством и будущей сертификацией.
- Для каждой процедуры сбора ооцитов предусмотрено одно устройство.
Камера Eggcell
Камера Eggcell с прикрепленной трубкой представляет собой одноразовое устройство, как показано на РИСУНКЕ 1A. После рассмотрения нескольких вариантов была выбрана система фильтрации внутри герметичной камеры, заполненной жидкостью.
Камера предварительно заполняется подогретой средой перед началом извлечения ооцитов. Во время аспирации фолликулов фолликулярная жидкость проходит в камеру и проходит через фильтр. Размер пор нейлонового фильтра (60х60 мкм) позволял удерживать ОКК, пропуская при этом клетки крови. Камера имеет размеры и состав, аналогичные стандартным чашкам для культивирования, что позволяет визуализировать содержимое под микроскопом на нагретом предметном столике для идентификации ОКК. Крышка закреплена стопорным кольцом, которое снимается в эмбриологической лаборатории только после того, как эмбриолог готов идентифицировать ОКК (РИСУНОК 1B).
В камере есть три порта:
· входной порт, соединенный трубкой со стандартной аспирационной иглой с маркировкой CE,
· отверстие для удаления отходов жидкости из камеры
· отверстие для выпуска воздуха в случае его непреднамеренного всасывания в камеру во время клинического использования.
Блок насоса/нагревателя
Блок насос/нагреватель показан на РИСУНКЕ 2.
Камера удерживается в вертикальном положении на нагреваемой пластине в передней части блока во время сбора (с горизонтальным фильтром), а затем поворачивается горизонтально для обнаружения ОКК под микроскопом на нагретом столике в эмбриологической лаборатории. Устройство содержит вакуум и насос, чтобы
(i) аспирировать жидкость из фолликула яичника и
(ii) протолкнуть жидкость в камеру и промыть иглу/фолликул яичника. Давление, используемое во время процедур, было подобрано таким образом, чтобы находиться в пределах диапазона, используемого в настоящее время в системе пробирка-помпа. Ряд клапанов регулируют направление потока жидкости. Варианты потока жидкости достигаются с помощью двух насосов и четырех клапанов
Изделие прошло ряд клинических исследований:
- на животных моделях – мыши, коровы
- здоровые добровольцы
- информированные пациенты, проходящие лечение бесплодия
Мониторинг температуры фолликулярной жидкости во время имитации извлечения ооцитов с использованием стандартной технологии по сравнению с Eggcell
При использовании стандартной технологии наблюдалось начальное падение с 36,38 ± 0,18°C (среднее значение ± стандартное отклонение) до 28,60 ± 1,24°C по мере аспирации предварительно нагретой фолликулярной жидкости в предварительно нагретые пробирки. Температура восстановилась до 32,27 ± 0,91°C, но заливка фолликулярной жидкости в предварительно подогретую чашку Петри на нагретом столике привела к дальнейшему быстрому снижению до 26,5 ± 1,39°C (РИСУНОК 3).
Температура восстановилась до 31,52 ± 0,60°C, но без покрытия маслом для предотвращения испарения температура продолжала падать. Различие в охлаждении при отключении воздушного потока подтверждало гипотезу о том, что падение температуры происходит в основном за счет потери скрытой теплоты испарения.
Для сравнения РИСУНОК 4 показывает, что при использовании Eggcell наблюдается лишь незначительное снижение температуры с исходного уровня 36,6 ± 0,27°C до минимальной температуры 34,30 ± 0,2°C.
При использовании стандартной технологии пробирки предварительно нагреваются, но пусты, поэтому наблюдается быстрое падение температуры, когда жидкость заполняет пробирку, тогда как при использовании Eggcell всасываемая жидкость смешивается с жидкостью, уже находящейся в камере, поэтому быстрая потеря температуры не наблюдается.
Небольшое снижение температуры, вероятно, связано с потерей тепла при переходе по трубке от иглы к камере. Кроме того, когда аспирация жидкости завершена, а Eggcell остается на насосе, температура восстанавливается после небольшого падения во время аспирации
Когда Eggcell открывали и помещали на нагретую подставку под микроскоп для имитации идентификации КОК, наблюдалась потеря тепла за счет испарения (РИСУНОК 5)
что также наблюдается при использовании стандартной технологии (РИСУНОК 3). Однако начальная температура в камере Eggcell выше, потому что жидкость не наливается в чашку, для идентификации ОКК; а вместо этого ОКК идентифицируются внутри открытой камеры
Образование бластоцисты (ТАБЛИЦА 1) было сравнимо между контрольными эмбрионами и эмбрионами, которые находились в прямом контакте с камерой Eggcell. Эти результаты свидетельствуют о том, что Eggcell не токсичен для эмбрионов мыши.
Выводы:
Было продемонстрировано, что Eggcell соответствует требуемой спецификации по температурной стабильности и применимости в клинической практике. В раннем клиническом исследовании Eggcell было показано, что проблем с безопасностью нет. Представленные здесь данные не преследуют цель продемонстрировать клиническую пользу на данном этапе, а представляют собой метод, с помощью которого это можно исследовать в дальнейшем
Основываясь на лабораторных данных, демонстрирующих влияние температуры на потенциал развития ооцитов, крайне важно поддерживать стабильную температуру ооцитов с момента сбора до идентификации в лаборатории.
В то же время мало критического анализа процедур извлечения ооцитов:
1. не известны параметры оптимального давления при аспирации и скорости потока фолликулярной жидкости. Хотя существует множество исследований давления аспирации в коллекциях ооцитов крупного рогатого скота, исследования на людях в основном касаются размера и конструкции игл (Horne et al., 1996; Rose, 2014). Ввиду отсутствия исследований прямого влияния давления при аспирации фолликулярной жидкости на ооциты человека, давление аспирации и скорость потока через иглу и трубку с использованием Eggcell устанавливались такими же, как рекомендуемые для аспирации из пробирки (от –120 до –140 мм рт. ст.). . Однако скорость потока внутри камеры Eggcell различна. Из-за большей площади фильтра по сравнению с трубкой скорость потока через фильтр будет во много раз меньше, чем через иглу.
2. В пробирке полученный ооцит находится под отрицательным давлением.
Когда пробка пробирки удаляется, давление быстро увеличивается до атмосферного. Несмотря на ограниченную сжимаемость жидкости, влияние такой скорости изменения давления на ооцит неизвестно.
В Eggcell ооциты будут находиться под отрицательным давлением в течение более длительного времени в камере, но могут не подвергаться таким быстрым колебаниям давления. Обнадеживает тот факт, что исследования клеточных культур не показывают повреждений из-за медленных или быстрых изменений давления (Tworkoski et al., 2018). Кроме того, ооцит находится под защитой кумулюсного комплекса.
Тем не менее, оптимальное давление для аспирированного ооцита еще предстоит определить.
3. Еще одним потенциальным преимуществом Eggcell, которое не было рассмотрено в этой статье, является стабильность pH. Во время забора ооцитов в пробирки концентрация растворенного диоксида углерода в фолликулярной жидкости уменьшается по мере ее смешивания с воздухом, что приводит к увеличению рН (Redding et al., 2006). Более того, температура и pH неразрывно связаны: понижение температуры связано с повышением pH среды (Swain and Pool, 2009). При использовании Eggcell нет контакта с воздухом и нет изменения pH. В отличии от эмбрионов у ооцитов нет механизмов регулирования внутриклеточного рН . У мышей клетки кумулюса могут придавать способность регулировать pH благодаря наличию щелевых соединений (FitzHarris et al., 2007), но мало исследований влияния pH на ооциты человека. Воздействие на ооциты субоптимального pH может нарушать позиционирование веретена, митохондриальную локализацию и метаболизм.
Авторы статьи считают, что за таким устройством будущее, хотя стоит еще много раз все перепроверить
