Original Aricle: Morphometric and immunohistochemical analysis as a
method to identify undifferentiated spermatogonial cells in adult
subjects with Klinefelter syndrome: a cohort study.
Nicholas A. Deebel, M.D.,a,b Haleh Soltanghoraee, M.D.,c,d Aaron William Bradshaw, M.D.,a,b Omar Abdelaal, M.D.,b,e Karl Reynolds, B.S.,b Stuart Howards, M.D.,a Stanley Kogan, M.D.,a,b Mohammad Reza Sadeghi, Ph.D.,c,d Anthony Atala, M.D.,a,b Kimberly Stogner-Underwood, M.D.,a,e and Hooman Sadri-Ardekani, M.D., Ph.D.
Fertility and Sterility, 2022.
Синдром Клайнфельтера (СК)— врожденное генетическое заболевание лиц мужского пола, обусловленное наличием в мужском кариотипе дополнительной половой Х-хромосомы (классический кариотип, 47 ХХУ).
Классические внешние проявления (фенотип) при данной патологии – высокий рост, гинекомастия, низкий уровень тестостерона, высокие значения гонадотропинов в крови, бесплодие.
Несмотря на довольно высокую частоту заболеваемости 1: 600, диагноз ставится при обращении мужчины к специалисту с проблемой бесплодия и выявленной азооспермии (отсутствие сперматозоидов в сперме).
Ранние исследования продемонстрировали наличие живых сперматозоидов у 44% мужчин с СК в образцах спермы, полученные TESЕ (забор сперматозоидов из ткани яичка хирургическим путем), при этом показатель живорождения с применением ИКСИ достигал 24% (Corona et al, 2017г.).
Цель настоящего исследования – выделить незрелые сперматогонии (предшественники сперматозоидов) в образцах биопсии ткани яичка у пациентов с СК, полученных методом TESA, с помощью стандартизированной окраски биоптатов гематокислином и эозином (H-E) и проведения иммуногистохимического анализа (ИГХ) с использованием UCHL1 (маркер стволовых и сперматогониальных клеток) и MAGE-A4 (ген, максимально экспрессирующийся в незрелых сперматогониях).
Материалы и методы. Дизайн исследования: ретроспективное когортное исследование за период с 2007 по 2017 гг. пациентов с СК и азооспермией, обращавшихся в Avicenna Research Institute по поводу бесплодия.
В каждом случае образец биоптата яичка оценивался эмбриологом на наличие сперматозоидов, далее проводилась гистоморфологическая оценка ткани.
Биоптат обрабатывали жидкостью Буэна и заливали в парафиновые блоки, срезы окрашивались Н-Е. Были измерены площади поверхности биоптатов левого и правого яичек, площадь поверхности каждого семенного канальца. Плотность и распределение положительных канальцев сравнивали между образцами, окрашенными H-E, с последующим морфологическим анализом, образцами, меченными UCHL1, и MAGE-A4.
Характеристика основной группы (n=79):
- Возраст 32,9 ± 0,7 года (диапазон от 16 до 48 лет);
- Средний рост и вес - 179,4 +/- 1,0 см и 82,6 +/- 2,1 кг;
- Кариотип 47, XXY, за исключением 1 субъекта (46, XY/47, XXY
- Средний размер яичек 2,9 +/- 0,3 мл (орхидометрия)
- Уровень ФСГ 40,0 +/- 2,1 мМЕ/мл (диапазон 0,9–97), ЛГ 21,0 +/- 1,1 мМЕ/мл (диапазон 0,7–48,4) и тестостерона - 2,5+/- 0,2 нг/мл (диапазон 0,5–8,2; [50-820 нг/дл];
- Билатеральная биопсия яичек.
Контрольную группу (n=12) составляли мужчины среднего возраста 52,5 (диапазон 10-78), ранее согласившиеся быть донорами органов в National Disease Research Interchange с кариотипом 46 XY. Исследованию также подвергались двусторонние образцы ткани яичек.
Критерии исключения: рак яичек, варикоцеле или крипторхизм.
Статистический анализ: GraphPad Prism.
Результаты исследования:
- Отношение площади поверхности семенных канальцев к общей площади яичка (TSA) было значительно ниже в основной группе (на 20,9%). А отношение площади интерстиция к TSA было значительно выше в популяции лиц с СК (79,1%) по сравнению с контрольной группой (45,1%)
- Уровни гонадотропных гормонов (ЛГ и ФСГ) и тестостерона, а также клинические параметры (рост, вес, возраст) не являются достоверным маркером наличия/отсутствия сперматогониев у пациентов с СК
- У 74,7% основной группы и 100% контрольных положительные результаты на UCHL1- меченые сперматогонии
- У 40,5% основной группы и 100% контрольных положительные результаты на MAGE–A4-меченые сперматогонии
- У 10,1% основной группы и 100% контрольных положительные результаты на сперматогонии на основании окраски H-E
Для пациентов с TESE «-» (т.е. отсутствие сперматозоидов в биоптате) проведен повторный ИГХ анализ (n=72):
- при окраске H &E - 1 (1,4%) положительный результат на сперматогонии
- с использованием либо UCHL1, либо MAGE-A4 - 54 (75,0%) положительный результат
- использование UCHL1 и MAGE-A4 - 20 (27,8%) положительный результат.
Заключение и обсуждение.
В этом исследовании изучалась распространенность сперматогоний в биоптатах ткани яичка среди взрослого населения с СК. С помощью методов иммуноокрашивания, проведения ИГХ анализа было показано, что распространенность сперматогониапозитивных биопсийных образцов у взрослых пациентов с СК составила 74,7%.
Что еще более важно, 75% испытуемых с «-» результатом TESE на сперматозоиды, были положительными на наличие незрелых сперматогоний в биоптате по данным ИГХ.
Интересный аспект, касающийся незрелых сперматозоидов, это аутотрансплантация сперматогониальных стволовых клеток (СКК) для решения проблемы бесплодия и возможности стать биологическим отцом при использовании методов ВРТ. Предположительно, сохранение сперматогониальных стволовых клеток может быть еще одной терапевтической стратегией у пациентов с СК с отрицательным результатом TESE.
Не смотря на тот факт, что исследования и поиск оптимального решения проблемы мужского бесплодия для пациентов с СК продолжаются, ожидается, что эти методы станут перспективными в терапии бесплодия у взрослых пациентов с КС, страдающих азооспермией с отрицательными результатами TESE.
