В современном мире можно часто услышать, что ученые секвенировали геном какого-нибудь животного. Как вообще на самом деле выглядит этот самый геном и как можно его исследовать и секвенировать? Попробуем разобраться в этой статье.
Начнем, пожалуй, с того, что геном- это совокупность генетической информации любого живого объекта, совокупность всех генов. Гены любого человека состоят из последовательностей нуклеотидов, т.е. в конечном итоге, после секвенирования, ученый видит очень длинные последовательности из 4 букв АТЦГ, которые бесконечно чередуются.
Секвенирование геномов является очень важным инструментом ученых. С помощью расшифровки можно узнать многое об организме, о том какие белки закодированы в этих буквах.
Сейчас существуют электронные базы данных, в которых содержатся расшифрованные последовательности геномов разных организмов, но также есть и полные последовательности, которые могут быть неисчисляемыми.
Что же делают для того, чтобы расшифровать последовательность? Для того, чтобы, например узнать какой организм у нас точно, т .е. его род и вид, мы можем взять праймеры, которые являются короткими известными последовательностями нашего искомого организма. Допустим, что мы ищем вирус в образце и вот мы взяли предполагаемый праймер и поставили ПЦР. Далее мы проверяем на электрофорезе длину нашего полученного фрагмента ДНК. Если результат положительный, мы выделяем из геля наш фрагмент и тщательно осаждаем его и очищаем.
После того, как у нас получился осадок ДНК, видимый глазом, мы помещаем его в специальный планшет и отправляем на расшифровку, т.е. секвенирование. Методов секвенирование довольно много, но сейчас попробуем разобраться с традиционным методом по Сэнгеру.
Секвенирование происходит в специальных приборах секвенаторах. Метод Сэнгера по-другому называют метод обрыва цепи ДНК. В смесь к ДНК добавляются дидезоксинуклеотиды: dATP, dGTP, dCTP и dTTP. Они присоединяются в цепи ДНК абсолютно в разных местах. Когда они встают на определенное место, то полимераза не может дальше строить цепь и синтез обрывается. Также в смеси есть флуоресцентные метки.Реакционную смесь разделяют капиллярным электрофорезом в растворе, фрагменты ДНК, выходящие из капиллярной колонки, регистрируются детектором флуоресценции. Результаты анализируют с помощью компьютера и представляют в виде последовательности разноцветных пиков, соответствующих четырём нуклеотидам. Секвенаторы такого типа могут «прочитывать» за один раз последовательности длиной 500—1000 нуклеотидов.
После того, как мы получили последовательность, загружаем ее в базу последовательностей нуклеотидов и она автоматически ищет нужный нам фрагмент и определяет какой организм был просеквенирован.
Сейчас широко используется метод нового поколения NGS. Появление NGS впервые позволило значительно ускорить и удешевить определение полной последовательности миллионов геномов организмов, начиная от бактерий и заканчивая человеком.Секвенирование «нового поколения» применяется как для анализа геномов организмов, для которых уже доступен референсный геном (ресеквенирование), так и для того, чтобы впервые расшифровать геном организма (секвенирование de novo).
Также существует пиросеквенирование. Основной смысл этого типа секвенирования заключается в последовательном синтезе ДНК на ДНК-фрагментах изучаемого организма в специальных пиколитровых «реакторах». В ходе синтеза дочерней цепочки ДНК определяют пирофосфаты, высвобождающиеся при включении нуклеотида в синтезируемую на матрице (участке молекулы ДНК, служащим матрицей для синтеза) комплементарную цепь.
Особо следует отметить тот факт, что подавляющее большинство NGS-методов требуют предварительной фрагментации ДНК для упрощения ферментативных реакций. К обоим концам фрагментированной ДНК «пришивают» ДНК-адаптеры (данная конструкция называется ДНК-библиотекой), необходимые для эмульсионной ПЦР (эПЦР) на магнитных сферах и последующего секвенирования.Готовые ДНК-библиотеки иммобилизуют на магнитных сферах. Затем магнитные сферы с нанесенной на них клональной библиотекой доставляют на проточную ячейку, где в присутствии праймера, дезоксинуклеотидтрифосфатов и ферментов — ДНК-полимеразы, люциферазы, АТФ-сульфурилазы — происходит циклический синтез новой цепи.
Технология секвенирования на молекулярных кластерах, так же как и пиросеквенирование, подразумевает синтез новой молекулы ДНК по матрице.Суть метода заключается в следующем. К обоим концам предварительно фрагментированной ДНК лигируют адаптеры, необходимые для ПЦР и последующего секвенирования на молекулярных кластерах. Полученные ДНК-библиотеки иммобилизуют на поверхности проточной ячейки, где и проводят циклический процесс секвенирования.
В наши дни происходит бурное развитие технологий, связанных с исследованием генов, белков; разрабатываются портативные, быстрые, точные и универсальные методы исследований биологических объектов. Новые математические и информационные технологии позволяют науке развиваться быстрее и использовать более сложные алгоритмы.
