В данном исследовании использовали принудительную экспрессию исключительно Sox2 и c-Myc в дополнение к определенным условиям культивирования для генерации мультипотентных НСК, способных дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты. В отличие от аналогичного подхода, при котором для прямой генерации НКС из фибробластов достаточно короткого введения ОСКМ (3-6 дней) с последующим культивированием в нейронной среде, клетки в протоколе бесоктенного конвертирования Oct4 никогда не переходили в плюрипотентное состояние . Анализ глобальной экспрессии генов и профиля метилирования ДНК выявил омоложение иНСК . Это свидетельствует о том, что для перепрограммирования индуцированного омоложения не требуется плюрипотентность. Интересно, что как по экспрессии генов, так и по метиломерному анализу высокопроходные iNSC были схожи с ННК, полученными с помощью iPSC, в то время как низкопроходные iNSC не были полностью омоложены. Это говорит о том, что деление клеток может быть важным для процесса клеточного омоложения.
Из этих исследований видно, что факторы старения, по-видимому, удаляются в процессе перепрограммирования. Как это достигается, неизвестно. Можно лишь строить догадки о потенциальных механизмах: факторы старения могут деградировать, разбавиться за счет клеточных делений, удаляться асимметричными клеточными делениями или, наоборот, лишь немногие клетки, свободные от факторов старения в стареющей популяции, могут быть успешно перепрограммированы. Последнее подтверждается тем фактом, что эффективность перепрограммирования чрезвычайно низка и даже снижается в клетках старых особей. Однако теория "элитной" клетки была недавно отвергнута на основании исследования с использованием одноклеточного картирования путем лентивирусной доставки клеточных меток. Разделение меченой популяции пополам до перепрограммирования выявило незначительное перекрытие успешно перепрограммированных линий между двумя образцами. Скорее клиринговая теория поддерживается наблюдением усиленной аутофагии на ранних стадиях перепрограммирования, что предполагает наличие клиринговой стадии. Однако усиление аутофагии может привести к клиренсу белковых агрегатов и аберрантных митохондрий, но то, что это повлияет на ядерную архитектуру или эпигенетические модификации, маловероятно. Таким образом, было бы важно отделить первичные факторы старения от вторичных эффектов их накопления. Эпигенетические изменения, как правило, рассматриваются как ядро перепрограммирования и омоложения. Однако наблюдение за тем, что для омоложения не требуется прохождение через плюрипотентное состояние, ослабляет эту гипотезу. Действительно, исследование Шенга и др. позволяет предположить, что деление клеток является ключом к успешному омоложению клеток. Основываясь на результатах исследований на дрожжах, можно предположить, что очистка факторов старения за счет асимметричной сегрегации между двумя дочерними клетками является возможным механизмом, однако до сих пор нет данных об асимметричном делении клеток в процессе перепрограммирования. Эти вопросы будут рассмотрены в ходе будущих экспериментов.
Прямое перепрограммирование сохраняет признаки старения
В последнее время были достигнуты заметные успехи в области непосредственно перепрограммированных нейронов. Генерация индуцированных нейронов (iN) достигается многими способами, в основном за счет сверхэкспрессии факторов пронейронной транскрипции в сочетании с нейронспецифичными микро РНК или коктейлем из малых молекул. Эти непосредственно генерируемые нейроны экспрессируют нейронные гены, генерируют потенциалы действия, формируют функциональные синапсы.
Интересно, что хотя перепрограммирование на основе iPSC с последующей дифференциацией стирает признаки старения, прямое перепрограммирование в нейроны не происходит. Сравнение нейронов, генерируемых трансдифференцировкой или классическим перепрограммированием из фибробластов у индивидуумов в возрасте от 0 до 89 лет, показало четкую разницу: если в iN сохранялись возраст зависимые различия в экспрессии, то в iPSC они стирались и при дифференциации на нейроны оставались транскрипционно омолаживаемыми. Аналогичным образом, нейроны, непосредственно перепрограммированные, но не полученные из iPSC, оставались с признаками старения, такими как повреждение ДНК, потеря гетерохроматина и ядерная организация. В соответствии с этим, изучение "эпигенетических часов" при изучении метилирования ДНК на конкретных островах CpG выявило высокую корреляцию между возрастом донорских фибробластов и непосредственно преобразованных иН.
Продолжение следует…
