Адреналин восстанавливает функции тромбоцитов, подавляемые тикагрелором: механистический подход. Продолжение 3

2.8. Экстракция белка и иммуноблоттинг

В качестве индикации активации пути PI3K было использовано фосфорилирование Akt, одного из нескольких нисходящих эффекторов PI3K. Тромбоциты стимулировали агонистами в присутствии 0,5 мм пептида RGDS (Sigma-Aldrich), чтобы предотвратить процесс амплификации, последовательный за связыванием фибриногена и сигнализацией “снаружи-внутрь”. После активации в течение 3 мин реакцию останавливали добавлением детергентного буфера (NuPAGE LDS, Invitrogen) и нагреванием при 70 °С в течение 10 мин. Белки отделяли SDS-PAGE на 10% акриламидном градиентном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Неспецифические сайты связывания блокировали путем инкубации в 20 мм Трис, 140 мм NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20 (TBST), содержащем 0,5% (w/v) молочного белка в течение 45 мин при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4 °C с кроличьим первичным антителом, анти-фосфо-Akt Ser473 (Cell Signalling, #9271) при мягком перемешивании. Окрашивание проводили с помощью антитела dylight 800 goat anti-rabbit Ig-G (Thermo Fisher Scientific) и изображения, записанного с помощью устройства Odyssey CLx Imager (LI-COR Biotechnology). Белковая нагрузка контролировалась путем зондирования мембран с помощью GAPDH (Abcam, Cambridge, UK). Количественное определение фосфорилирования акт проводили с помощью программного обеспечения ImageJ и выражали в произвольных единицах.

2.9. Статистический анализ

Количественные данные были выражены в виде медиан [минимум-максимум] или квадратов с усеченными участками, показывающих медиану, интерквартильный размах, минимальные и максимальные значения, или гистограмм с медианой и максимальными значениями. Статистический анализ проводился с помощью программы Prism v6. 0 (GraphPad software, CA). Для сравнения использовались непараметрические тесты. Сравнение переменных проводилось с помощью критерия Фридмана, за которым следовал критерий Вилкоксона (парные выборки) или критерий Манна-Уитни (независимые выборки). Все статистические тесты были двусторонними и Р

3. Результаты

3.1. В отсутствие тикагрелора адреналин потенцирует АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов

Как и ожидалось, АДФ не индуцировал агрегацию отмытых тромбоцитов в отсутствие фибриногена (данные не показаны). В присутствии фибриногена АДФ индуцировал агрегацию тромбоцитов, которая спонтанно дезагрегировалась с течением времени ( рис.2). 1А, Б, В). Напротив, адреналин индуцировал очень слабую агрегацию (6 [4-13] против 59 [54-73]%, для адреналина и АДФ соответственно, Р Адреналин и АДФ в комбинации индуцировали значительно более сильную агрегацию, чем АДФ (или адреналин) самостоятельно, достигая уровня агрегации, индуцированного 10 мкм PAR-1-AP (87 [76-94] против 84 [76-93]%, P=0,62). Таким образом, адреналин и АДФ проявляли синергические эффекты.

1. Адреналин восстанавливает АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов, ингибируемую тикагрелором А-типичный временной ход агрегации тромбоцитов с использованием агрегометрии светопропускания. Промытые тромбоциты, предварительно обработанные 150 Нм тикагрелором или транспортным средством, активировали различными агонистами (10 мкм АДФ, 10 мкм адреналина (ЭПИ) или комбинацией АДФ и ЭПИ) в присутствии фибриногена (300 мкг/мл). Б-сравнение процента максимальной агрегации промытой тромбоцитарной массы, стимулированной 10 мкм АДФ, 10 мкм эпинефрина (ЭПИ), комбинацией обоих или 10 мкм PAR-1-AP, в отсутствие или присутствии 150 Нм тикагрелора (n=6). Боксы представляют собой интерквартильный размах и медианное значение, а бакенбарды-минимальное и максимальное наблюдаемые значения. Все образцы сравнивались с результатами, полученными только с АДФ (*P Кроме того, агрегация, индуцированная на ADP+EPI, сравнивалась с агрегацией, полученной с PAR-1-AP. С-Кинетика дезагрегации тромбоцитов (в процентах), отражающая стабильность агрегатов тромбоцитов через 1, 2 и 3 мин после достижения максимальной агрегации. Сравнение в тикагрелор-спайковых образцах при стимуляции АДФ и ЭПИ по сравнению с тикагрелор-спайковыми образцами при стимуляции АДФ (n=3), *P Результаты выражаются в медиане и максимуме.