Бластоцист является одним из наиболее распространенных кишечных паразитов, заражающих людей и животных во всем мире. Как правило, бластоцистоз обычно передается через загрязненную кистами воду и пищу по фекально-росовому пути, который является основным способом передачи. Патогенность бластоциста еще не ясна, есть исследования, связывающие его с симптомами различных желудочно-кишечных расстройств, таких как синдром раздраженного кишечника и воспалительная болезнь кишечника. Однако несколько микробиомных исследований показали, что бластоцист является распространенным соразмерным заболеванием кишечника человека и может увеличить разнообразие микробиоты кишечника.
Помимо людей, этот паразит часто встречается у широкого круга животных-хозяев, включая нечеловекообразных приматов и других млекопитающих, таких как артиодактиль, периссодактиль, хобоциды, грызуны и сумчатые, а также птиц, рептилий, земноводных, рыб, аннелид и насекомых.
В настоящее время на основе анализа последовательности генов малых субъединиц рибосомальной РНК бластоцистиса было выявлено по меньшей мере 26 подтипов у людей и животных во всем мире. Подтипы 1-9 и ST12 были обнаружены у людей; некоторые из них также наблюдались у животных, такие как ST3 у нечеловеческих приматов, ST5 у скота и свиней, ST7 у птиц и ST8 у приматов и птиц, что указывает на зоонотический потенциал. И наоборот, некоторые подтипы, такие как ST10 и ST14, циркулируют преимущественно в определенных животных-хозяевах и никогда не появлялись в человеческих инфекциях, что указывает на специфичность хозяев.
Материалы и методы
1. Заявление по вопросам этики
Исследование было проведено в соответствии с указаниями Положения об управлении делами экспериментальных животных и одобрено Комитетом по этике животных Сычуаньского сельскохозяйственного университета. В процессе отбора проб не было причинено вреда животным. Разрешение на сбор образцов фекалий было получено от Китайского гигантского центра защиты панды и исследований. Все процедуры проводились в соответствии с утвержденными методическими указаниями.
2. Взятие проб
В период с августа 2017 года по октябрь 2018 года с 81 гигантской панды, 23 красных панды, 38 черных лебедей, 11 румяных шелдуков и 15 зеленых глухих птиц были собраны на исследовательской базе в Ченду провинции Сычуань, юго-восточный Китай. Оба вида панд проживают в открытых загонах этого заведения. Образцы фекалий панды были собраны стерильными перчатками из земли сразу же после испражнения. Затем пробы помещались в стерильные пластиковые контейнеры с указанием возраста, пола и даты отбора проб. Все черные лебеди и черные шелдаки были выращены в небольшом парке отдыха на территории панды, а зелёные глухие птицы были свободно выгуливаемыми. Образцы фекалий были отобраны из птичьих клеток с осторожностью, чтобы собрать только ту часть, которая не имела прямого контакта с клеткой, чтобы избежать загрязнения. Пробы помещались в стерильные пластиковые контейнеры с маркировкой вида птицы и временем отбора проб. Все образцы фекалий перед анализом хранились в 2,5% растворе дихромата калия при температуре 4°С.
3. Извлечение ДНК
Дихромат калия удаляли из фекалий дистиллированной водой путем центрифугирования при 1500 × г в течение 10 минут. Геномная ДНК была извлечена из каждого фекального образца по адресу ∼200 мг с помощью мини-инструментария ДНК QIAamp. Извлеченная ДНК хранилась при температуре -20 °C до ПЦР-анализа.
4. ПЦР-усиление
Все препараты ДНК были проверены на наличие бластоцистиса методом ПЦР-амплификации области штрих-кода, праймеры и параметры цикличности были использованы. ПЦР-положительные препараты ДНК были дополнительно проанализированы для определения подтипов изолятов бластоцистов путем последовательного анализа области штрихкодов в соответствии с терминологией для подтипов бластоцистов - консенсус. Для всех ПЦР реакций использовалась ДНК-полимераза TaKaRa Taq. Отрицательный контроль без добавления ДНК был включен во все тесты ПЦР. Продукты ПЦР подвергались электрофорезу в геле с агарозой 1,5% и визуализировались путем окрашивания геля бромистым этидием.
5. Секвенирование и анализ нуклеотидов
Все положительные продукты ПЦР были непосредственно секвенированы на анализаторе ДНК ABI PRISMTM 3730 с использованием набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Полученные в настоящем исследовании нуклеотидные последовательности были подвергнуты поиску в рамках BLAST, а затем выровнены и проанализированы друг с другом. С помощью программы Clustal X 2.0 из базы данных GenBank были загружены последовательности ссылок для определения подтипов изолятов бластоцистов. Последовательности нуклеотидов, сформированные в данной работе, были помещены в GenBank под номерами присоединения MK742731-M K742737.
6. Филогенетический анализ
Для оценки генетических связей между подтипами Blastocystis, полученных в настоящем исследовании и выявленных в предыдущих исследованиях, с использованием программного обеспечения Mega 6, было построено соседнее дерево. Эволюционные расстояния рассчитывались с использованием двухпараметрической модели Кимуры. Надежность деревьев была оценена с помощью анализа бутстрап с 1000 копиями.
7. Анализ данных
Статистический анализ проводился с использованием SPSS версии 22.0. Тест хи-квадрат и 95% доверительные интервалы использовались для сравнения распространенности бластоцистита между возрастными группами, половыми группами и различными видами. Различия были признаны статистически значимыми при значениях P <0.05.
Результаты: Распространенность бластоцистита
ПЦР-амплификация области штрих-кодов гена рРНК СБУ показала, что из 168 образцов 19 (11,3%) подтвердили наличие инфекций бластоциста. Самая высокая распространенность отмечена в чертовой шелдуке (18,2%, 2/11), за которой следуют гигантские панды (12,3%, 10/81). Распространенность бластоцистита у черных лебедей, красных панд и зеленых глухих птиц составила 10,5%, 8,7% и 6,7% соответственно. Между распространенностью и различными видами значимых ассоциаций не наблюдалось (χ2 = 1.107, df = 4, P > 0.05). При этом наибольшая распространенность наблюдается в возрасте >5 лет (14,8%, 8/54), затем 8,7% (2/23) в возрасте 1,5-5,5 лет и 0% в возрасте <1,5 лет, однако разница была незначительной (χ2 = 1,654, df = 2 P, 0,05). Аналогично, разница была несущественной между самцами (16.4%, 10/61) и самками (16.9%, 14/83) гигантских панд (χ2 = 0.014, df = 1, P > 0.05).
