Анды в Южной Америке признаны "горячими точками" для птичьего эндемизма. Этот регион включает в себя около 133 различных экосистем с более чем 2000 видами птиц, включая почти 600 эндемичных видов. Такое богатство видов-хозяев, по-видимому, обусловливает высокое разнообразие птичьих гемоспоридных паразитов, которое только начинает характеризоваться методами микроскопии и полимеразной цепной реакции.
Молекулярные методы дают значительные преимущества для обнаружения паразитов, особенно в образцах с очень низким уровнем паразитов. Многие молекулярные протоколы, направленные на различные молекулярные маркеры, такие как рРНК, ядерные последовательности, апикопласт и митохондриальных генов были использованы с целью диагностики. В настоящее время большинство описей гемоспоридов птиц основаны на молекулярном обнаружении. К сожалению, большинство последовательностей гемоспоридов, в том числе лейкоцитозона, зарегистрированных в неотропиках, остаются без связи с морфо-видами, поскольку мало исследований применялось как микроскопическая, так и молекулярная диагностика параллельно.
Материалы и методы
1. Места проведения исследований
840 птиц 139 видов были пойманы с помощью туманных сетей в центральных и восточных горных хребтах Анд Колумбии. В центральной горной цепи в апреле, июле, августе, декабре 2015 г. и январе 2016 г. было отловлено 686 птиц 118 видов. В восточной части горного хребта в январе 2015 г. и декабре 2016 г. на территории Боскского дворца Чингаса, который является зоной обитания Андского леса, было поймано 154 птицы, принадлежащих к 42 видам.
2. Отбор проб и анализ пленки крови
Образцы крови отбирали путем прокола плечевой или тарзальной вены или обрезки ногтей. На каждую птицу было сделано по три тонких мазка, и 50 мкл крови хранилось в антикоагулянтном растворе EDTA или буфере SET. Кровяные пленки высушивали воздухом непосредственно в поле, а затем фиксировали абсолютным метанолом и окрашивали 30% раствором Джемсы в лаборатории по данным Valkiūnas. Интенсивность паразитизма определялась фактическим подсчетом количества инфицированных клеток на 10 000 эритроцитов. Для определения статистической значимости средних значений морфометрических паразитных измерений в XLSTAT был использован t-тест студента.
3. Извлечение ДНК, амплификация ПЦР и секвенирование гена цитохрома b и митохондриального генома ДНК
Очистку продуктов ПЦР проводили с использованием этанола и ацетата аммония по протоколу Bensch et al., а затем визуализировали на 1,5% агарозном геле. Все очищенные продукты ПЦР были впоследствии секвенированы. Для всех имеющихся образцов, инфицированных новым видом лейкоцитозона, было проведено пять независимых исследований и проведено тщательное визуальное обследование электроферограмм для подтверждения того, что полученные последовательности не являются химерными продуктами в результате смешанных инфекций.
Помимо гена цитба, были амплифицированы, клонированы и секвенированы два митохондриальных генома лейкоцитозона из одной волнистой антипитты и одного зелено-черного фруктовика. Продукты ПЦР были усилены полимеразой TaKaRa LA TaqTM. Условия ПЦР были следующими: частичная денатурация при 94 °C в течение 1 минуты и 30 циклов по 30 секунд при 94 °C и 7 минут при 68 °C, с последующим окончательным продлением на 10 минут при 72 °C.
4. Анализ праймеров
Аффинированность праймеров, предложенных Hellgren et al., с последовательностями генов цитбы, полученными от паразитов лейкоцитозона, оценивали путем выравнивания олигонуклеотидов с линиями паразитов, развивающимися в клетках хозяев округлых форм, таких как Leucocytozoon fringillinarum и L. dubreuili и линий, полученных от паразитов.
5. Этическое утверждение
Отлов птиц и манипуляции с ними осуществлялись таким образом, чтобы уменьшить стресс, вызванный этими действиями. Как только были взяты образцы крови, птиц выпустили. Работа на местах проводилась с разрешения "Unidad Administrationrativa Especial del Sistema de Parques Nacionales Naturales de Colombia UAESPNN - Subdirección técnica" и "Autoridad Nacional de Licencias Ambientales, ANLA".
Результаты: Распространенность инфекции и описание паразитов
Инфекции лейкоцитозона были обнаружены у 10 птиц из 840 обследованных путем микроскопического исследования мазков крови. Молекулярная характеристика проводилась только на положительных образцах путем микроскопических исследований. В то время как гаметоциты лейкоцитозона квинзы, L fringillinarum и Leucocytozoon sp. наблюдались у 8 особей, принадлежащих к Emberizidae, Parulidae, Thraupidae и Trochilidae, два новых морфологических легко отличительных вида лейкоцитозона были обнаружены у пассарядов южскоамериканского происхождения, 2011; BirdLife International, 2017a, 2017b: один волнистый муравейник и один зелено-черный фруктовик.
В целом, птицы Antpitta неуловимы, редко встречаются и требуют больших усилий при отлове и отборе проб. Зеленые и черные фруктоядные птицы - древесные птицы, обитающие в тропических влажных горных лесах высотой 1000-3300 метров от Перу до Венесуэлы.
