Семейство черепах Testudinidae включает 49 живых видов черепах 12 сохранившихся родов, все из которых полностью наземные и которые вместе составляют около 18% сохранившегося мирового черепашьего разнообразия. Тестудиниды являются наиболее широко распространенным семейством неморских черепах, встречающимся на всех субполярных континентах, кроме Австралии, и занимающим широкое разнообразие мест обитания, начиная от дождевых лесов в Юго-Восточной Азии и Южной Америке и заканчивая пустынями в Северной Америке и Африке.
Морфологически черепахи также демонстрируют большое разнообразие размеров и форм. Самые крупные черепахи на Галапагосских островах достигают 1,5 м в длину, но крапчатый виселица созревает только на 10 см в длину. Большинство родов имеют сильно куполообразные и жесткие карапасы, но карапасы с откидной спинкой встречаются в роде Киниксис, а у рода Малакохерс замечательный карапас с откидной спинкой, занимающий щели скал. Несмотря на предыдущие исследования, филогенетические связи в семействе Testudinidae оставались спорными.
Кроме того, все молекулярно-тестудинидные исследования до сих пор носили ограниченный характер в плане таксономической выборки, поскольку они касались специфических вопросов взаимоотношений в рамках небольших подмножеств семейства. Эти исследования включали отношения в роде Gopherus, происхождение и взаимоотношения малагасийских черепах, происхождение галапагосских черепах, происхождение индийских черепах, отношения в роде Indotestudo и отношения в роде Testudo.
Тем не менее, монофилия семьи постоянно поддерживается как молекулярными, так и морфологическими исследованиями, с двумя группами: Гемиды и Эмиды считались сестрами тестудинидов. Особенно проблематичным оказалось установление монофилии рода Geochelone в пределах ареала Testudinidae.
Ученые предложили шесть подгенер для Geochelone на основе зоогеографических критериев, однако некоторые ученые были против их полного использования на основе своего кладического анализа с использованием 26 черепных символов. Это мнение было также подтверждено более поздними анализами, которые включали больше символов и таксонов. Результаты также не поддерживали монофилии Геокелона. Кроме того, недавние молекулярные исследования показали наличие парафилета малагасийского геокелона в отношении пиксиса, или обеспечили небольшое разрешение между геокелоном и другими родами тестудинидов.
Все эти молекулярные исследования ограничивались митохондриальными генами и включали только подмножество видов геокелонов. С точки зрения биогеографической истории черепахи представляют интерес для изучения благодаря своему почти всемирному распространению, включая океанические острова, такие как Галапагоссы, Ост-Индия, Вест-Индия, Мадагаскар, Маскаренские острова и др. Исследование предоставило наиболее детальное обсуждение диверентных биогеографических сценариев тестудинидов на сегодняшний день.
Было предположено, что настоящие черепахи происходят из Северной Америки, основываясь на обнаружении древнейшего ископаемого тестудинида, Hadrianus majusculus, из раннего эоцена. Также было предположено, что черепахи из Европы и Африки более тесно связаны с азиатскими формами, чем с североамериканскими, и что черепахи Галапагосских островов и Индийского океана сплавлялись на эти острова. Последний сценарий рассредоточения поддерживается более поздними исследованиями.
Однако происхождение южноамериканских черепах остается предметом споров. Большинство авторов пришли к выводу, что черепахи вторглись в тропические районы Южной Америки из Северной или Центральной Америки. Основной целью исследования было получение филогена тестудинидов на основе расширенного набора данных молекулярного характера, который был бы всеобъемлющим на общем уровне и включал бы все виды, доступные для нас (большинство видов). В конечном счете, нам удалось включить виды, представляющие все признанные и ранее существовавшие виды и подвиды, представляющие в общей сложности 65% всех видов тестудинидов.
Этот широкий таксономический отбор образцов был признан особенно важным для решения филогенетических связей в рамках проблемного рода Geochelone, и для этой группы ученые смогли охватить все виды Geochelone. Для достоверной оценки филогенезии включили большое разнообразие генов, включая один митохондриальный ген кодирования белка, два митохондриальных рибосомных гена и два ядерных гена, последний из которых ранее не использовался для разрешения взаимоотношений между черепахами.
Материалы и методы
Таксономическая выборка
Для тестудинидной ингруппы было включено 34 таксона (32 вида и 2 подвида). Также включили все виды Геохелоны. Для двух видов: Indotestudo forstenii и Gopherus agassizii, для которых ученые не смогли получить ткани; последовательности для этих видов были получены из GenBank. Этот молекулярно-филогенетический анализ включает наиболее полный на сегодняшний день отбор проб таксонов для тестудинидов. Для аутгрупп включили два вида Geoemydae и два вида Emydidae на основании их родственных связей с тестинидами, выявленных морфологическими и молекулярными данными.
И митохондриальная, и ядерная ДНК были использованы в данном исследовании для разрешения взаимоотношений на всех филогенетических уровнях в семье. Аналогичные подходы оказались успешными и для других групп, демонстрирующих аналогичные уровни филогенетического разнообразия. Также ученые секвенировали три области митохондриальной ДНК: полную последовательность цитохрома b и разделы генов 12S и 16S рРНК.
ДНК была извлечена из тканей и образцов крови с помощью набора DNeasy Kit (Циаген) в соответствии с инструкциями производителя тканей животных. Объем ПЦР для митохондриальных генов содержал 42,2 л. Ядерная ДНК была амплицирована HotStar Taq Mastermix (Циаген), так как этот так хорошо работает на образцах с низкокопическими мишенями, а так является высокоспецифичным.
Объем ПЦР состоит из 21 л (5 л воды, 2 л каждой грунтовки, 10 л мастера-микса Taq и 2 л ДНК или выше в зависимости от количества ДНК в растворе экстракции Wnal). Условия ПЦР для ядерных генов были такими же, как и выше, за исключением того, что первая ступень (95 °C) была выполнена за 15 минут, а температура отжига для Rag2 и Cmos составила 52 и 58 °C соответственно. Продукты ПЦР визуализировались с помощью электрофореза через 2% низкотемпературный агарозный гель, окрашенный бромистым этидием.
Для реакций реамплификации ПЦР продукты ПЦР вырезались из геля с помощью дозатора Pasteur, а заглушка геля расплавлялась в стерильной воде 300 л при 73 °C в течение 10 минут. Полученный гель-очищенный продукт использовался в качестве шаблона при 42.2 л реакциях реампликации со всеми ПЦР условиями, аналогичными тем, которые использовались для митохондриальных генов. Продукты ПЦР очищались пластиной и циклами с использованием Terminalator в соответствии с рекомендациями производителя. Последовательности генерировались в обоих направлениях на генетическом анализаторе.
Филогенетический анализ
Анализ данных проводился как параметрическими, так и непараметрическими методами: максимальная экономия и максимальная вероятность с использованием PAUP*4.0b10 и байесовский анализ с использованием MrBayes v3.1. Для анализа максимальной экономности был проведен эвристический анализ со 100 случайными репликациями добавления таксонов с использованием алгоритма подмены ветвей деревьев и соединений (TBR) в PAUP, без установления верхнего предела для максимального количества сохраненных деревьев.
Все персонажи были одинаково взвешены и упорядочены. Разрывы в выравнивании последовательностей рассматривались как состояние знака Wfth. Филогенетическая конгруэнтность между разделами ядерного и митохондриального наборов данных оценивалась с помощью теста на разницу длин несогласованности. Хотя полезность этого теста в качестве меры для комбинирования данных была поставлена под сомнение, ученые использовали этот тест для дальнейшего изучения характеристик разделенных данных, наряду с филогенетическим анализом, который они также провели с использованием этих же разделов.
Эти данные были разделены генами и органеллой ДНК (ядерной или митохондриальной), а также проанализированы во всей их полноте. Для анализа максимальной вероятности оптимальная модель эволюции нуклеотидов была определена с помощью модельного теста V3.7. Анализы использовали случайно выбранное стартовое дерево, эвристический поиск с простым добавлением таксонов и алгоритмом подмены ветвей TBR. Подтверждение вероятности гипотезы было оценено с помощью бутстрап-анализа со 100 репликациями и простым добавлением таксонов.
Анализ проводился с использованием случайного стартового дерева и длился в течение 5-106 поколений фунтов стерлингов. Четыре марковские цепи, одна холодная и три нагретые, отбирались каждые 1000 поколений. Лог-вероятностные баллы точек отбора проб были построены с учетом времени генерации для определения стационарности марковских цепей.
Деревья, образовавшиеся до стационарности, были удалены из анализов Унала с помощью функции выгорания. Два независимых анализа были начаты одновременно. Сообщаются значения задней вероятности для всех кладов в дереве консенсуса по правилам внутреннего большинства. Ученые провели анализ как комбинированных, так и разбитых на разделы наборов данных для изучения надежности топологии деревьев.
