Эти методы были применены для преобразования клеток бактерий, водорослей, растений, грибов и животных. В клетках человека генетическая трансформация в настоящее время используется для вакцинации, тканевой инженерии и онкологической терапии.
Даже если биологические и химические методы все еще более популярны для генетической трансформации, в последнее время наблюдается рост применения физических методов, а именно перемешивание стеклянными бусинами, вакуумная инфильтрация, карбид кремния, лазерные микропучки, ультразвук и ударно-волновые преобразования.
Перемешивание стеклянными бусинами
Клетки могут быть генетически трансформированы путем быстрого перемешивания стеклянными бусинами в присутствии носителя и ДНК плазмиды.
Этот метод может быть выполнен без сложных устройств и не требует химической обработки или ферментативных реакций.
Эта методика проста, дешева и конкурирует с электропорацией, поскольку является наименее затратной по времени. Но она также является одной из наименее эффективных, поскольку при этом повреждается большое количество ДНК и резко снижается жизнеспособность клеток.
Эта методика впервые использовалась с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, а чуть позже и с другими бактериями и водорослями.
Вакуумная инфильтрация
Другой способ опосредованного включения агробактерий для генетической трансформации заключается в применении вакуума в течение определенного периода времени.
Физически вакуум создает отрицательное атмосферное давление, которое приводит к уменьшению воздушного пространства между клетками в мембране, позволяя проникновению Agrobacterium в межклеточные пространства клеток.
Чем дольше длительность и чем ниже давление, тем меньше воздушного пространства внутри ткани растения. Однако, температура, рН и время индукции генов вирулентности оказывают отрицательное влияние на частоту трансформации.
Преимущество этой процедуры заключается в том, что она является быстрой и отличается низкой сомакональной изменчивостью, так как в ней не задействована культура тканей.
Основным его ограничением является то, что некоторые штаммы Agrobacterium не могут инфицировать определенные типы клеток. Вакуумная инфильтрация первоначально использовалась для трансформации арабидопсиса.
Этот метод использовался для производства вакцины растительного происхождения в соответствии с действующими правилами надлежащей производственной практики для клинических испытаний на людях. Однако он не применялся для трансформации бактерий или клеток животных в связи с опухолевой недостаточностью Agrobacterium.
Использование карбида кремния
Волокна карбида кремния способны проникать в клетки, не убивая их. Используя это свойство, был предложен метод преобразования с помощью карбида кремния (SiC) для преобразования культур кукурузы и табака.
Это простая, дешевая и быстрая процедура, которая может быть эффективно реализована для различных типов клеток. Однако она имеет низкую эффективность трансформации и может повредить клетки, влияющие на их способность к регенерации тканей.
Карбид кремния добавляют во взвешенное состояние тканей и плазмидную ДНК с помощью блендера, который создает необходимую «воронку» из клеток. Карбид кремния с ДНК проникает в клеточную мембрану через небольшие отверстия, образовавшиеся при столкновениях между растительными клетками и карбидом кремния.
Лазерные микропули
Полная манипуляция лазерным светом позволяет аккуратно обрабатывать клетки, субклеточные структуры и даже отдельные молекулы ДНК, и, в частности, используется в клетках животных.
Для этого требуется надежная лазерная система (например, азотные лазеры, лазеры на красителях с эксимерной накачкой или титано-сапфировые лазеры), которая может использоваться в качестве оптического пинцета в сочетании с соответствующим микроскопом.
Однако подобный метод практически не используют из-за того, что это очень дорогостоящая техника и трудоемкая работа.
Ультразвук
Ультразвуковое волновое преобразование, также известное как сонификация, основано на сонопоре (разрыве клеточных мембран акустическими волнами).
Это неинвазивный способ введения молекул ДНК в клетки посредством акустической кавитации, которая временно изменяет проницаемость клеточной мембраны.
Ультразвуковое исследование повышает эффективность трансфекции клеток животных, тканей in vitro и протопластов с пространственной и временной специфичностью.
Однако ультразвук может повредить клетку, полностью разрушая ее мембрану. Поэтому важнейшими параметрами использования ультразвука являются время интенсивности воздействия, центральная частота, тип применения (непрерывное или импульсное), частота повторения импульсов и рабочий цикл.
Ударные волны
Это импульсы давления с пиковым положительным давлением в диапазоне от 30 до 150 Мпа. Они производятся электрогидравлическими, электромагнитными или пьезоэлектрическими генераторами ударных волн.
Точный механизм, ответственный за проницаемость клеток с помощью ударных волн, до сих пор не ясен, но есть предположение, что это связано с кавитацией, вызванной ударной волной.
