Материалы и методы
1. Клеточная культура
Мезенхимальные стволовые клетки человеческой кости были собраны из головки бедренной кости доноров, перенесших операцию эндопротезирования тазобедренного сустава в связи с переломами шейки бедра. В общей сложности 15 × 106 hBMSCs были посеяны в посуде и выращены с минимально необходимой средой α, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота и 100 U/ml пенициллином и стрептомицином. hBMSCs были использованы для экспериментов на проходах. Культурная среда менялась ежедневно, и прозрачная лента и парафильм использовались для сохранения концентрации алкоголя в ходе соответствующей процедуры.
2. Токсичность клеток и распространение
Для определения пролиферации 5×103 чБМ были засеяны 96-луночными планшетами, выращенными с использованием 50 мМ этанола и/или различных концентраций бетаина в течение 1, 3, 5 и 7 дней. Для оценки клеточной пролиферации под воздействием алкоголя и бетаина в соответствии с рекомендациями производителя был проведен анализ жизнеспособности клеток. Поглощение на 450 нм измерялось спектрофотометрическим считывателем микропланшетов.
3. Остеогенная индукция
Остеогенную дифференцирующую среду применяли в течение 7, 14 или 21 дня для стимуляции остеогенной дифференциации ГМСК. Базальную культуральную среду дополняли 10-2 Мβ-глицерофосфатом натрия, 5 × 10-5 М L-аскорбиновой кислотой и 10-7 М дексаметазоном после посева клеток в течение 48 ч.
4. Красное окрашивание ализарином и активность ALP
Остеогенную дифференциацию и отложения кальция исследовали с помощью анализа активности щелочной фосфатазы (ALP) на 7 и 14 день и красного ализарина (ARS) на 21 день. Культурную среду через 48 ч заменили остеогенной средой, чтобы вызвать остеогенную дифференциацию. Активность ALP измерялась на основе соотношения образцов к стандартным и представлена в миллимолях о-нитрофенола, вырабатываемого в минуту на миллиграмм белка.
5. RT-PCR RT-PCR
Уровни экспрессии генов остеокальцина и КМБ-2 измерялись с помощью qRT-PCR. Общая мРНК, выделенная реагентом TRIzol, была обратно транскрибирована с помощью одноэтапного удаления гДНК Easyscript и супермикса синтеза кДНК. ПЦР обратной транскрипции проводили на ABI HT7900, и относительные уровни экспрессии OCN и BMP2 были нормализованы до β-актина.
6. Западная промокашка
Белки извлекали из hBMSCs с помощью клеточного лизисного буфера с ингибитором протеиназы. Всего на гелях SDS-PAGE было проведено электрофорезирование 20 мг экстракта и его перенос на мембраны PVDF, которые оценивались с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты. Мембраны обработаны первичными антителами. Затем мембраны инкубировали с помощью соответствующего вторичного антитела. Для анализа целевых полос после хемилюминесценции использовали LEICA DM 4000. Уровни белка были нормализованы до β-актина, а для количественной оценки белка использовалось программное обеспечение ImageJ.
7. Группировка животных и лечение бетаином
Тридцать самцов крыс SD были использованы для модели животных в этом исследовании и были разделены поровну на три группы: нормальная контрольная группа, алкоголь, и алкоголь + бетаин группы. Этанолсодержащая питьевая вода была подготовлена перед экспериментом для адаптации. В течение 6 недель кормления алкоголем в группе AL крысы первоначально получали 5% алкоголя, который увеличивался на 5% в неделю и оставался на уровне 30% на прошлой неделе. Постепенно увеличивающаяся концентрация алкоголя в корме приемлема для крыс и проще и гуманнее, чем лаваж. Крысы в группе AL + бетаин получали тот же протокол кормления алкоголем и дополнительные внутрибетаминальные инъекции бетаина в течение этого периода. Все крысы получали маркировку флуоресценции внутрибрюшинными инъекциями по 30 мг/кг ализарина красного и 10 мг/кг кальцина зеленого на четвертой и шестой неделях отдельно.
8. Гистологическое окрашивание
Проксимальные бедра были получены через 6 недель и зафиксированы 4% параформальдегидом в течение 72 ч. ЭДТА использовали для удаления накипи в течение месяца, прежде чем образцы были введены в парафин. Затем были выделены участки размером 5 мкм для окрашивания гематоксилина и эозина и иммуногистохимического окрашивания OCN и COL1 для оценки субхондральной трабекулярной структуры. Снимки были сделаны с помощью микроскопа LEICA DM 4000.
9. Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS 20.0. Все данные проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа для сравнения с поправкой Бонферрони. Статистически значимые различия учитывались, когда значения P были меньше 0,05.
Бетаин спас этанол-индуцированное торможение остеогенной дифференциации и минерализации hBMSCs, индуцированное этанолом
BMSCs являются основными остеопрогениторными клетками для регенерации костей. После инкубации этанолом в течение 5 и 7 дней количество ЧМСК несколько увеличилось по сравнению с контрольной группой, что было выявлено при анализе методом CCK-8. Существенных различий между другими группами не наблюдалось.
