Технология CRISPR - это простой, но мощный инструмент для редактирования генома. Он позволяет легко изменять последовательности ДНК и функцию генов. Его потенциальные применения включают в себя исправление генетических дефектов, лечение и предотвращение распространенных болезней и даже улучшение урожая. Однако, использование данной технологии вызывает ряд этических вопросов.
CRISPR (полное название CRISPR-Cas9) - это специализированные участки ДНК. Фермент Cas9 - это пара молекулярных ножниц, которые могут вырезать нити ДНК.
Технология CRISPR была создана на подобии защитных природных механизмов бактерий архей - одноклеточных микроорганизмов. Эти организмы используют полученную РНК и белки Cas9 для борьбы с вирусами и инородными телами, измельчая и уничтожая ДНК захватчика. Когда такие компоненты переносятся на другие, более сложные организмы, это позволяет "манипулировать" генами и редактировать их.
CRISPR - дословно означает "кластеры регулярных промежуточных коротких палиндромных повторов". Это специализированная область ДНК, состоящая из прямых повторяющихся последовательностей, разделенных уникальными последовательностями - спейсерами. Повторяющиеся последовательности нуклеотидов - структурные блоки ДНК - распространяются по всей области CRISPR.
В случае бактерий, спейсеры берутся из вирусов, ранее атаковавших организм. Они служат неким банком воспоминаний, благодаря которому бактерии распознают вирусы и борются с будущими атаками.
Впервые это экспериментально продемонстрировала группа исследователей из Danisco - компании, которая производит пищевые ингредиенты. Согласно публикации в журнале Science, исследователи использовали бактерии Streptococcus thermophilus, которые встречаются в йогурте и других молочных продуктах. Ученые отметили, что после вирусной атаки в область CRISPR были включены новые спейсеры. Последовательность ДНК этих спейсеров была идентична части генома вируса. Они манипулировали этими спейсерами, "вынимая" их или вводя новые вирусные последовательности. Таким образом, появилась возможность изменять устойчивость бактерий к атаке определенного вируса. Ученые подтвердили, что CRISPR играет важную роль в регулировании бактериального иммунитета.
РНК CRISPR (crRNA) - после включения спейсера и повторного заражения, вирусная часть CRISPR транскрибируется и обрабатывается в РНК CRISPR. Нуклеотидная последовательность CRISPR является "шаблоном" для получения комплементарной последовательности одноцепочечной РНК. Каждая РНК состоит из нуклеотидного повтора и спейсерной части.
Cas9 - белок Cas9 представляет собой фермент, который "режет" чужую ДНК.
Белок обычно связывается с двумя молекулами РНК - crRNAb и tracrRNA (транс-активирующая crRNA). Затем Cas9 направляется туда, где его будут вырезать. Это место ДНК является комплементарным 20-нуклеотидному участку crRNA.
Используя две отдельные области в своей структуре, Cas9 разрезает обе нити двойной спирали ДНК - это называется двухцепочечным разрывом.
Существует встроенный механизм безопасности, который гарантирует, что Cas9 не разрежет ничего в ненужном месте. Короткие последовательности, или РАМ (последовательность, прилегающая к протоспейсеру), являются метками и располагаются с целевой ДНК-последовательностью. Если Cas9 не видит РАМ рядом с его целевой последовательностью ДНК, он не будет вырезаться. Это одна из причин, почему Cas9 никогда не атакует регион CRISPR в бактериях.
CRISPR-Cas9 как инструмент для редактирования генома
Геном различных организмов кодирует серию сообщений и инструкций в своих последовательностях ДНК. Редактирование генома включает в себя изменение этих последовательностей. Это можно сделать разрезав ДНК, обманывая механизмы восстановления естественной ДНК клетки, внося изменения, которые вы захотите. CRISPR-Cas9 предоставляет все средства для этого.
В 2012 году в журналах Science и PNAS были опубликованы две научные статьи, которые помогли превратить бактериальный CRISPR-Cas9 в простой, программируемый инструмент для редактирования генома.
Исследователи из разных групп пришли к выводу, что Cas9 может быть направлен на вырезание любой области ДНК. Это можно сделать, изменив нуклеотидную последовательность сrRNA, которая связывается с дополнительной целью ДНК. Ученые упростили систему, путем слияния crRNA и tracrRNA, чтобы создать единую "руководящую" РНК. Отсюда следует вывод, что для редактирования генома требуются только два компонента - руководящая РНК и белок Cas9.
"В оперативном плане вы составляете участок из 20 нуклеотидных пар оснований, которые соответствуют гену, который вы хотите отредактировать", - Джордж Черн, профессор генетики в Гарвардской медицинской школе. "Важно обеспечить то, чтобы нуклеотидная последовательность была обнаружена только в целевом гене и нигде больше в самом геноме. Тогда РНК и белок Cas9 будет вырезать как ножницами ДНК на этом участке и нигде более".
После того, как ДНК вырезана, естественные механизмы восстановления клетки активируются и начинают работать над выведением мутаций и других изменений в геноме. Это может происходить двумя способами. Согласно проекту в университете Стэндфорда, один метод включает склейку двух урезаний вместе. Этот метод, называющийся "негомологичное соединение концов", как правило, позволяет избежать ошибок. Нуклеотиды, случайно вставленные или удаленные, в результате мутаций могут нарушить ген. Во втором методе разрыв фиксируется путем заполнения зазора последовательностью нуклеотидов. Для этого клетка использует короткую нить ДНК в качестве шаблона. Ученые могут подать шаблон ДНК по своему выбору, тем самым, записывая любой ген, который захотят, или исправляя мутацию.
CRISPR-Cas9 стал популярным в последние годы. Данная технология проста в применении и в четыре раза эффективнее, чем предыдущий, устаревший инструмент для редактирования генома (TALENS).
Исследования, проведенные с использованием лабораторных животных с человеческими заболеваниями, продемонстрировали то, что технология может быть эффективна для коррекции генетических дефектов. Примерами таких заболеваний являются кистозный фиброз, катаракта и анемия. Эти исследования прокладывают путь для терапевтического применения у людей.
«Я думаю, что общественное восприятие CRISPR очень сфокусировано на идее использования генетического редактирования для лечения болезней», - говорит Невилл Санджана из New York Genome Center, доцент кафедры биологии, нейробиологии и физиологии. "Это без сомнения, захватывающая возможность, но это только одна маленькая часть из всех возможностей".
Технология CRISPR также применялась в пищевой и сельскохозяйственной промышленности для разработки пробиотических культур и для вакцинации промышленных культур против вирусов. Она используется в сельскохозяйственных культурах для повышения урожайности, засухоустойчивости и улучшения питательных свойств.
Еще одно потенциальное применение - создания "генного драйва". Это генетические системы, которые увеличивают вероятность того, что конкретный признак переходит от родителя к ребенку. В течении поколений, признак распространится по всем потомкам. Генный драйв может помочь в борьбе с распространением таких заболеваний, как малярия, путем стерильности среди векторов болезни - москитов. Кроме того, они могут быть использованы для искоренения инвазивных видов и обратного воздействия пестицидов и гербицидов.
Однако CRISPR-Cas9 не лишен недостатков. Он не эффективен на 100 процентов. Более того, эффективность редактирования генома может меняться. В исследовании, проведенном на рисе, редактирование генов произошло почти в 50 процентах клеток, которые получили комплекс Cas9-РНК. А другие анализы показали, что в зависимости от цели, эффективность редактирования может достигать 80 и более процентов.
Существует также "феномен эффектов вне цели", где ДНК разрезается в местах, отличных от намеченной цели. Это может привести к появлению непреднамеренных мутаций. Кроме того, что даже если система режет по цели, есть вероятность, получить не точное редактирование. Этому дали название "геном-вандал".
Многие потенциальные применения технологии CRISPR вызывают вопросы об этических достоинствах и последствиях переделки генов.
У использования генного драйва есть потенциальное экологического воздействие. Введенное изменение может распространятся за пределы целевой популяции на другие организмы путем скрещивания. Генные драйвы также могут уменьшить генетическое разнообразие целевой популяции.
Создание генетических модификаций человеческого эмбриона и репродуктивных клеток, таких как сперма и яйцеклетка, известно, как редактирование зародышевой линии. Поскольку изменения этих клеток может передаваться по наследству, использование технологии CRISPR для внесения изменения в зародышевую линию вызывает ряд этических проблем.
Изменчивая эффективность, нецелевые эффекты и неточные изменения создают риски для безопасности. Редактирование зародышевой линии повышает вероятность непредвиденных последствий для будущих поколений, поскольку мы еще ограничены в знаниях о генетике человека, взаимодействиях между генами и окружающей средой и путями заболевания.
Другие этические проблемы довольно тонки. Должны ли мы вносить изменения, которые могут кардинально повлиять на будущие поколения без их согласия? Что делать, если использование редактирования зародышевой линии сводится к тому, чтобы улучшить различные характеристики человека?
Пока редактирование генов будет производится только для исцеления от серьезных заболеваний, и только тогда, когда нет альтернативного лечения. Но для этого необходимо собрать максимальное количество данных о рисках и преимуществе процедуры для здоровья. Также необходим полный контроль во время клинических испытаний.
И напоследок, некоторые последние исследования:
◾️ В 2017 году группа ученых выпустила исследование в журнале Science о том, что они запрограммировали молекулу CRISPR для поиска штаммов вирусов, таких как вирус Зика, в сыворотке крови, моче и слюне.
◾️ 2 августа 2017 года в журнале Nature были опубликованы результаты работы, где говорилось об успешном удалении дефекта сердца у эмбриона используя CRISPR.
◾️ 2 января 2018 года ученые объявили, что могут останавливать грибок, который угрожает в производстве шоколада. CRISPR использовался, чтобы сделать растения более устойчивыми к болезням.
◾️ 16 апреля 2018 года в журнале BioNews было опубликовано исследование, в котором ученые объявили о редактировании тысяч генов одновременно, используя CRISPR.
👍 👍 👍
