К 50-м годам прошлого столетия стало ясно, что генетическая информация содержится в молекуле ДНК. В 1953 Уотсон и Крик предложили модель строения молекулы ДНК.
Рассказывают,что когда двое праздновали свое открытие в одном из кембриджских баров, подвыпивший Уотсон заявил, что они разгадали главную тайну жизни, отчего даже не страдавший от избытка скромности Крик несколько опешил. Разумеется, открытие структуры ДНК - одно из важнейших событий в истории биологии, но с разгадкой главной тайны жизни Уотсон все-таки погорячился.
Мало установить структуру ДНК, нужно еще суметь ее прочитать и правильно проинтерпретировать. И если полностью расшифровать геном человека вряд ли удастся в обозримом будущем, уж больно необъятная задача, то вот в чтении ДНК человечество достигло больших успехов.
Можно сказать, что секвенирование (прочтение) ДНК - это одна из самых бурно развивающихся отраслей научно-технического прогресса в течении последних двадцати лет. На картинке ниже приведен график. Прямая линия - это закон Мура,согласно которому число транзисторов на кристалле интегральной схемы каждый год увеличивается в два раза, то есть растет в геометрической прогрессии. Действительно впечатляющая закономерность и наглядное свидетельство скорости научно-технического прогресса. Однако посмотрите на линию изменения стоимости секвенирования. Возможности чтения ДНК развиваются еще быстрее.
Достаточно сказать,что “Проект Геном человека” в девяностых и начале нулевых потребовал международного сотрудничества и более 3 млрд. долларов бюджета, а сегодня вы можете просеквенировать свой собственный геном за 100-200 тыс. рублей. Справедливости ради, технологии секвенирования приближаются к пределу физических ограничений, и в ближайшем будущем рост ощутимо замедлится. Впрочем, насколько я понимаю, транзисторов это тоже касается.
В этом небольшом цикле заметок мне бы хотелось вкратце осветить, как развивались методы секвенирования ДНК, начиная с методов из далеких семидесятых и заканчивая современностью.
Первым распространенным методом прочтения ДНК стало так называемое секвенирование по Максаму-Гилберту. Этот метод основан на химически специфическом разрыве ДНК.
Молекула ДНК содержит четыре основных типа нуклеотидов (звеньев): тимин (Т), аденин(А), гуанин(G) и цитозин(С). Тип нуклеотида определяется азотистым основанием, входящим в его состав. Цитозин и тимин относятся к пиримидиновым основаниям (одно кольцо в азотистом основании), а аденин и гуанин - к пуриновым (два кольца в основании). Эти химические особенности можно использовать для того, чтобы отличить один нуклеотид от другого.
Давайте представим, что молекула ДНК - это лист, на котором написан некий текст (к метафоре ДНК как листка бумаги мы вернемся еще не раз). Сами буквы мы прочитать не можем, но у нас есть волшебные ножницы, которым можно дать команду “разрезать после случайной буквы T” или “режь по букве А или G”. В реальности роль ножниц играют химические реактивы. Например, если ДНК в кислых условиях обработать пиперидином, то произойдет обрыв цепи после пуринового основания (А или G). А если предварительно обработать диметилсульфатом,то расщепление произойдет только после гуанина. При помощи гидразина можно осуществить обрыв цепи ДНК после пиримидинов (С и Т).
Теперь возьмем много-много копий текста и каждую разрежем нашими ножницами в случайных местах. Мы получим множество лоскутков разной длины, и именно длина обрезков позволит установить последовательность букв в исходном тексте.Если мы попросим ножницы разрезать после Т, и получим лоскуты длиной 3, 5, 9, значит, на 3, 5 и 9 позициях стоит Т. А если затем попросим разрезать по C и Т, и получим лоскуты длин 1, 3, 5, 7 и 9, то точно можем сказать, что на 1 и 7 позиции С, потому что на 3, 5 и 9 стоит Т. Таким образом можно полностью восстановить весь текст.
Секвенирование по Максаму-Гилберту получило широкое распространение благодаря высокой точности и доступности, однако плохо подходило для автоматизации. Этот недостаток оказался критичным, когда понадобилось секвенировать по-настоящему длинные последовательности, и на смену Максаму-Гилберту пришло секвенирование по Сэнгеру, о котором мы поговорим в следующей части.
Автор: Даниил Будяк.