В предыдущей заметке мы говорили о том,как стремительно развивались технологии прочтения ДНК в течении последних двадцати лет, и вкратце рассмотрели принцип действия самого первого метода секвенирования (по Максаму-Гилберту). Однако по-настоящему прорывные вещи, разделившие генетику на догеномную и постгеномную эры, случились благодаря другому методу, так называемому секвенированию по Сэнгеру.
Примечательно,что метод Сэнегера появился примерно в то же время,что и Максама Гилберта ,но на первых порах ему уступал.Прежде всего из-за денег.. В методе Максама-Гилберта используются доступные небиологичексие реагенты,в то время как в Сэнгере задействованы сложные и дорогие по тогдашним временам ферментативные системы.Кроме того, методом Сэнгера нельзя было читать ДНК совсем уж с нуля. Забегая немного вперед,скажем, что в Сэнгере осуществляется многократное копирование молекулы ДНК при помощи специального фермента-ДНК полимеразы. Сама по себе полимераза не может связаться с ДНК.Для этого необходимо подобрать затравку - небольшой фрагмент, на который полимераза сможет сесть и начать копирование. Последовательность букв в затравке нужно знать заранее.
Чаша весов начала склоняться в сторону метода Сэнгера когда понадобилось секвенировать по-настоящему длинные последовательности. Оказалось,что метод Сэнгера хорошо поддается автоматизации, чего нельзя было сказать про Максама-Гилберта.На сегодняшний день секвенирование по Максаму-Гилберту является фактом истории: вряд ли в мире осталось хотя бы одна лаборатория, в которой все еще применяют этот метод. Сэнгер же по прежнему актуален и даже является своего рода золотым стандартом.
Поговорим о механизме. Если при описании Максама-Гилберта привлекали метафору разрезаемого листа бумаги, то в Сэнгере,наоборот, ДНК копируется множество раз в ходе так называемой Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР).
Как вы,наверное, знаете, ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу.В ходе ПЦР молекула расплетается, и с каждой из переплетенных цепей связывается та самая затравка, которую нужно подобрать заранее, и которая служит аэродромом для посадки полимеразы, достраивающей к одиночной цепи вторую.Таким образом из одной молекулы ДНК получается две, затем цикл повторяется и из двух молекул получается четыре, из четырех восемь и так много много раз. Поэтому реакция и называется цепной.
Мы размножили ДНК, но пока не понятно,как это поможет помочь установить ее структуру. Хитрость в том,что в среду добавляется два типа нуклеотидов: большинство обычных, из которых в норме ДНК и состоит,и небольшое количество особых. Особость заключается в наличии специальной флуоресцирующей метки, позволяющей идентифицировать тип нуклеотида (А,Т,G или С), а так же в отсутствии ОН группы у третьего углерода. В норме через эту OH группу происходит связывание со следующим нуклеотидом в цепи.
Если ДНК-полимераза использует нуклеотид без ОН группы для синтеза новой ДНК, то следующий нуклеотид не сможет быть присоединен, и произойдет обрыв цепи.Если повторить процедуру достаточное число циклов, то “особые” нуклеотиды встроятся на каждую из позиций. Мы получим много обрывков разной длины, и у каждого на конце будет особый нуклеотид, который можем распознать. Прибор разделяет куски разной длины в камере фореза(длинные молекулы движутся в электрическом поле медленнее,чем короткие), и считывает интенсивность свечения метки на последнем нуклеотиде.Таким образом,для каждой позиции определяется тип нуклеотида.
Как и десятки лет назад, главной проблемой метода Сэнегра остается цена. В конце девяностых-начале нулевых самое первое прочтение генома человека обошлось в 3 млрд долларов. Разумеется,сейчас стоимость секвенирования по Сэнгеру, гораздо ниже ( во многом благодаря наработкам, сделанным в ходе Генома человека), но все равно достаточно высока. В настоящее время большинство выполняется при помощи так называемых секвенаторов второго поколения, более производительных, но имеющих свои ограничения.
Сейчас Сэнгер Занимает нишу старого коня, который борозды, как известно,не портит. По сравнению с новыми методами, Сэнгер отличается высокой точностью и надежностью. Его применяют для проверки противоречивых данных или для прочтения последовательностей, которые, по какой либо причине не могут быть прочитаны другим методом.
Автор: Даниил Будяк