В двух предыдущих статьях я уже разобрала некоторые ошибки при ПЦР: отсутствие полосок, а также грязный контроль и шмеры.
Теперь пришло время обсудить оставшиеся проблемы, а именно (1) полоски есть не для всех образцов или для некоторых образцов они бледные (2) двойные полоски.
Пример:
В верхнем ряду образцы 241, 245, 246, 247, 254, 258 с яркой полоской, 257 - с бледной полоской, 248, 250 и 255 - с отчетливыми несколькими полосками. 242, 252 и 256 - не получились. 251 яркий, но с небольшим шмером, но эта проблема была обсуждена ранее.
Какие есть варианты?
(1) В случае бледных полосок или их отсутствия, для начала надо проверить следующие пункты:
- Прокрутили ли вы пробирки со смесью для ПЦР на вортексе до того, как поставить их в ПЦР машинку? Если нет, то в каких-то случаях ДНК могла остаться на стенке и ПЦР реакция не пройдет.
- Действительно ли вы хорошо залили ПЦР продукт в лунки для геля? Не был ли гель жидким, не были ли разорваны стенки в лунках? Не было ли пузырей в гелях, особенно там, где лунки? Если что-то из этого присутствовало, то в некоторых лунках ПЦР продукт мог вылиться в гель, и в таком случае он полоску не образует.
Если тут все в порядке, то, возможно дело в образцах. Соответствующие образцы сами по себе могли быть старыми или неправильно хранились. Если вы ставите ПЦР для разных надвидовых групп, то ПЦР может проходить для разных групп по-разному, потому что праймеры могут на них садиться с разной вероятностью. Если этот вариант возможен, то есть несколько вещей, которые стоит попробовать:
- Другой набор для выделения ДНК. Может, стоит купить более дорогой набор, либо набор, специально предназначенный для малых количеств ДНК Например, Qiagen предлагает Investigator kit.
- Более мощную Taq-полимеразу. Например, Евроген предлагает Tersus и Encyclo. Я не пробовала Tersus, но Encyclo действительно дает лучший результат. Но, поскольку она более чувствительна, то и грязные контроль, шмеры и двойные полоски с ней бывают чаще.
- ПЦР протокол с пониженной температурой отжига, повышенным содержанием магния или с большим количеством циклов. Все эти модификации ведут к тому, что больше праймеров садятся на ДНК, но и вероятность образования неспецифического продукта тоже повышается.
- Стоит попробовать step-up протокол, когда 5-10 первых циклов ПЦР проводится на более низких температурах отжига. Это повышает количество выхода ДНК.
- В пробирку для ПЦР добавить больше матрицы ДНК. Например, если вы обычно добавляете 1 мкл, то добавить 2 мкл. Если вы добавляете 2, то добавить 3 мкл.
- При бледных полосках можно очистить ДНК в этой полоске от геля (есть специальные наборы для очистки из геля), и использовать ее в качестве матрицы для следующего раунда ПЦР, тогда результат может быть лучше. Полоску будет видно только при свете ультрафиолета. При вырезании полоски из геля, обязательно надевайте маску, которая защитит лицо от вредного излучения и убедитесь, что все части вашего тела закрыты одеждой.
(2) Наличие двойных, тройных и т.д. полосок означает, что праймеры сели на какой-то неспецифический отрезок. Таким образом, у вас в пробирке два или более продукта, а вам нужен только один. Тут можно попробовать следующие варианты:
- Повысить температуру отжига ПЦР реакции, это может понизить активность праймеров и приведет к тому, что будет амплифицирован только нужный продукт.
- Уменьшить количество циклов ПЦР реакции.
- Попробовать step-down протокол. Он включает 5-10 первых циклов при более высокой температуре отжига, чтобы амплифицировался только специфический продукт , и потом ПЦР реакция будет идти главным образом для него.
- Понизить количество магния, если вы его добавляете в реакцию
- Можно понизить количество ДНК матрицы.
- Измерьте концентрацию тотальной ДНК. Если она выше 50 нг/мкл, то можно ее разбавить по крайней мере в два раза. Если в образце есть еще какие-то организмы, кроме нужного, это уменьшит их концентрацию. Конечно, это уменьшит и концентрацию и нужной ДНК, но если чужеродной ДНК будет совсем мало, то, возможно, ПЦР с ней не пройдет. Это вполне действенный метод для свежих экземпляров.
- Также можно вырезать из геля полоску, которая соответствует нужной длине (для этого мы и используем маркер длин во время постановки геля), очистить ее от геля и провести еще одну ПЦР реакцию, используя очищенный продукт в качестве матрицы. Опять, будьте очень осторожны, работая при включенном ультрафиолете!