До этого я написала про то, что делать, если полосок на геле не видно. Даже если у вас получились полоски на геле, и означает, что получилось выделение и ПЦР идет, все равно результат вас может не устроить. Не устраивает результат обычно в пяти случаях: (1) Полоски есть, но также есть полоса в отрицательном контроле. (2) Есть шмеры. Шмер - это широкая нечеткая полоса. (3) Полоски есть, но бледные. (4) Полоски имеются не у всех образцов. 5) У некоторых образцов есть дополнительные полоски.
Давайте разберем подробнее проблемы, и посмотрим, как это выглядит на гелях (про то, как ставить гель-электрофорез, я написала тут и тут).
Сначала посмотрим то, каким гель должен быть в приближенном к идеалу случае.
В первых ячейках на каждой линии на геле - маркер длин, он всегда состоит из многих полосок, по которым можно определить длину ПЦР продукта в образце. Маркер длин можно закапывать в любую ячейку, главное, чтобы вам было удобно и понятно. Полоски, которые соответствуют пробам - это яркий ряд. Под ним более бледно светятся полоски, которые соответствую остаткам праймера. Они могут быть более или менее яркими или очень бледными, это зависит от нескольких факторов. Тут все полоски, соответствующие пробам, четкие. Контроль (К), чистый. Можно смело все образцы отправить на секвенирование. В некоторых случаях (образцы 278 и 279) есть легкая шмеристость, но очистка образцов должна ее убрать.
1) Проблема один. Полоска в контроле.
Контроль тут после образца 198. Видно, что есть четкая полоска. В таком случае, к сожалению, надо выбросить все образцы.
Почему такое может произойти?
В самом лучшем случае, вы неаккуратно раскапали ПЦР-микс, и немного ДНК из проб попало в контроль. В таком случае вам просто надо раскапать все заново аккуратнее.
В худшем случае такой результат может означать, что у вас контаминирован какой-то реактив для ПЦР-микса, и это может быть все, что угодно. Например, вы залезли грязным носиком в пробирку с каким-то реактивом. Возможно, вы оставили реактив с открытой крышкой на какое-то более или менее продолжительное время, и туда попала какая-то грязь. Возможно, вода, которую вы используете недостаточно чистая. Контаминация может быть видна при постановке ПЦР для одного маркера, но отсутствовать для другого, даже если вы используете одинаковые реактивы. Тут может быть дело в чувствительности праймеров. Специфичные праймеры с меньшей вероятностью амплифицируют что-то, кроме нужного образца.
Что делать в худшем случае? Возможны два пути. Первый путь - подумать, какой реактив скорее всего пострадал и его заменить. Если ничего не изменилось, заменять по очереди все остальные. Второй путь, более быстрый, - это выкинуть все реактивы, и заменить на новые. Что из этого вы выберете, решать вам. В моей истории был случай, когда помогла только покупка воды, очищенной от всего, включая нуклеотиды. Стоила она довольно дорого, но по крайней мере, я добилась чистого контроля.
Могу добавить еще, что полоска в контроле - это очень обидная вещь. Вы потратили реактивы и время на постановку ПЦР (скорее всего 3-4 часа), и вам пришлось выкинуть все образцы. Но что делать, такое бывает. Нужно аккуратно относиться к реактивам, хранить их в морозильнике, ну и иногда все-таки приходится их выкидывать и заменять на новые.
А вот пример, когда контаминация в контроле может не помешать отправке на секвенирование - верхний ряд, после образца 198.
Как видно, там есть размытость (шмеристость), однако она выше, чем целевые маркеры. К тому же эта шмеристость отсутствует в образцах. Скорее всего в этом случае была контаминирована только пробирка с контролем, и образцы на самом деле не испорчены.
2) Наличие шмера вместо или вместе с полоской. Шмером называется, например, то, что видно в образце 232 на этом геле.
В данном случае полоска довольно четкая и шмер бледный, зато контроль (К) чистый. Так что образец можно почистить и отправить на секвенирование, и все должно получиться.
А вот в этом случае (образец 279 - крайней в третьем ряду) шмер гораздо более серьезнее, и в этом случае образец скорее всего придется выкинуть, и разбираться, что пошло не так.
Еще один пример шмера, который не пригоден для дальнейшей работы, - образец 186 на следующем геле, тут даже нет четкой полоски, просто бледные разводы.
Почему так может происходить? Во-первых, такое бывает, если у вас малая концентрация целевого маркера, но при этом праймеры могут прочитать что-то еще, кроме нужного места. Тогда получаются несколько полосок и все бледные. Что можно сделать? Можно вырезать из геля участок, который соответствует нужной длине (тут легко определить, потому что есть образцы, которые получились ярко, и можно вырезать фрагмент на этом уровне). Его можно очистить, и использовать как матрицу для последующей ПЦР. Скорее всего полоска в нужном месте получится ярче, но это не будет гарантировать, что там только нужная последовательность. Но это вы сможете узнать, только если отправите образец на секвенирование. Если у вас есть дополнительные материал, то можно подумать, как выделить ДНК так, чтобы повысить ее концентрацию. Возможно, уменьшить объем элюирующего раствора, увеличить количество образца, который вы берете на выделение, или выбрать другой способ выделения.
Во-вторых, шмеры могут появляться, если у вас слишком высокие концентрации, и поэтому выявляется контаминация. Например, такое может быть, если вы работаете со свежими образцами и используете слишком много материала для выделения. В таком случае, вы можете либо разбавить выделенную ДНК в 5-10 раз, и переставить ПЦР. Вы можете также выделить ДНК из меньшего количества материала. Еще один способ - это использовать более высокие температуры отжига при ПЦР, чтобы амплификация была более специфичной.
В-третьих, какая-то контаминация попала в конкретный образец, даже если его концентрация нормальная. Возможно, концентрация там и была изначально, например, какие-то внутренние паразиты. В таком случае, надо попробовать повысить температуру отжига, или выделить ДНК из другого образца.
В-четвертых, шмеры могут появляться, если вы неправильно замешали ПЦР-микс. Например, добавили слишком много праймеров или нуклеотидов. Но в таком случае, шмеры будут у всех образцов.
В следующей статье я разберу другие проблемы, связанные с результатами ПЦР.