Ранее я написала о том, зачем нужна очистка ПЦР продуктов.
Основные способы очистки ПЦР продуктов можно разбить на три вида.
1) Очистка на колонках. Принцип тот же, что и для выделения ДНК. Берем колонку, выливаем туда ДНК, несколько раз промываем. В итоге в пробирке остаются фрагменты ПЦР-продуктов, а все ненужное остается в колонке, которая выкидывается. Вот примеры таких наборов:
Евроген https://evrogen.ru/products/isolation/cleanup
Thermo-Fisher: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K310001
Производителей гораздо больше, и если вы захотите очищать ПЦР-продукты с помощью колонок, есть смысл поизучать рынок, цены и протоколы.
Плюс наборов для очистки на колонках в том, что их так же можно использовать для очистки из геля. Например, если у вас стабильно получается двойная полоска на геле, можно вырезать ту, что соответствует нужной длине, и ее очистить. Потом можно поставить ПЦР реакцию стандартным способом, использую очищенный ДНК продукт вместо тотальной ДНК. Однако надо прочитать руководство к тому набору, который вы будете использовать, чтобы узнать, есть ли там такая опция. У набора Еврогена точно есть.
2) Магнитные частицы. Тот же принцип, что и очистка тотальной ДНК, магнитные частицы кладут в пробирки с ПЦР продуктом и ставят около специального магнита. Частицы связываются с двойными отрезками ДНК и притягиваются к магниту. Все остальное, что остается в пробирке сливается. Примеры:
Евроген: https://evrogen.ru/products/isolation/cleanmag
Sigma-Aldrich https://www.sigmaaldrich.com/RU/en/technical-documents/protocol/genomics/pcr/highprep-pcr-purification
Я поизучала интернет, и у меня впечатление, что наборов для выделения на магнитных частицах меньше, чем наборов с колонками. Также, не забывайте, что к этому набору нужен специальный штатив с магнитом, и надо точно узнать, поставляется ли он с набором или его надо отдельно купить.
3) Очистка с помощью ферментов. У нас в клетках есть специальные ферменты, которые называются экзонуклеазы. Их задача - разрушать одноцепочечные молекулы ДНК. Эти ферменты как-то синтезируют или выделяют из клеток, и их можно использовать для очистки. По протоколу их надо добавить в пробирку с ПЦР продуктом, немного нагреть (можно в той же ПЦР машинке), и все, можно секвенировать.
ThermoFisher https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/78205.10.ML
Судя по всему, Термофишер производит самые популярные экзонуклеазы, хотя вроде как есть и эти ферменты других фирм.
Самый быстрый и эффективный способ очистки - это ферментативная очистка. Однако это и самые дорогой способ, по крайней мере, в наших текущих условиях. В России экзонуклеазы, насколько я знаю, не производят. Я много узнавала, и пока все мне говорят, что отечественных нет (если я ошибаюсь, то буду благодарна, если напишите, кто их производит у нас). Приходится покупать заграничные с большой наценкой.
Все остальные методы требуют некоторой возни с переливанием из пробирки в пробирку. А это означает, что пробирки надо подписать и ничего не перепутать, и часто не по одному разу. Если проб много, то это занимает много времени. Например, процедура очистки на колонках Еврогена у меня занимает 2-3 часа на 20-30 образцов. Причем отвлекаться и отдохнуть и попить чайку нельзя. Более того, есть риск контаминации, потому что все же пробирки надо открывать и что-то из них доставать. Что касается ферментов, то надо их закапать в пробирки, и поставить в ПЦР машинку, потом снять и поставить в морозилку, поэтому риск контаминации минимальный.
Также надо помнить, что в отличие от ферментативной очистки, при использовании колонок и магнитных частиц, происходит потеря ПЦР продукта. Если вы знаете, что у вас и так концентрации ПЦР продукта невысокие, то, возможно, вам эти два метода не подойдут. К тому же, по крайней мере Евроген для очистки на колонках просит, чтобы объем ПЦР-продукта был не менее 100 мкл. На самом деле, это довольно много, обычно его делают примерно в два раза меньше, 20 мкл хватает для секвенирования, а при хороших концентрациях и того меньше. Таким образом, вы будете тратить в четыре раза больше реактивов и ДНК для постановки ПЦР, и это не самое экономное решение. Ладно еще цена реактивов (хотя, возможно, очистка ферментами все равно будет дороже), ДНК тоже не очень хочется избыточно тратить, особенно, если образцы редкие. Мы очищаем меньшие объемы, но я признаюсь, что удовлетворительный результат получается только для митохондриальных маркеров, а ядерные получаются очень плохо на секвенировании.
Еще надо сказать, что есть умельцы, которые очищают ПЦР продукты без всяких наборов и это получается очень дешево. Но я не знаю этих протоколов. И, разумеется, если это не ферменты, то там скорее всего, такие же проблемы, как с потерей концентрации, временем и возможной контаминацией.
