Вернемся к сложной, но важной теме секвенирования.
В прошлой части я рассказывала, что такое ДНК, как она копируется, что такое гены и какие их мутации могут привести к онкологии.
А что же значит секвенирование?
По сути, это чтение ДНК, то есть определение последовательности нуклеотидов. И было бы прекрасно, если бы в лаборатории могли взять клеточку и прочесть всю последовательность ДНК, чтобы найти те самые ошибки. Но сделать это не так-то просто.
Впрочем, в каждой нашей клеточке так много ДНК, что есть шанс прочесть последовательность более точно. Мне понравилось объяснение данной методики на сайте habr от пользователя baceolus.
Представьте, что у вас есть очень много листочков с одинаковым текстом, а потом вы их разрезаете на мелкие кусочки и перемешиваете. Так как текст одинаковый, а места разрезов разные, то вы сможете восстановить исходный текст. Правда, это займёт много времени и не факт, что не будет ошибок.
Так и с ДНК. Одну молекулу клонируют и разрезают в разных местах, получая так называемые риды. Сумма этих ридов должна быть намного больше длины самой ДНК. В одной процедуре секвенирования участвуют более миллиона разных ридов.
А при чем здесь ПЦР?
ПЦР или полимеразная цепная реакция - это один из методов поиска мутаций в генах. Он довольно востребован, но, увы, его точность далека от совершенства.
Если объяснять вкратце, то для метода ПЦР не требуется подготовка ридов. При этом совершенно необходимо знать ген и мутацию, которую нужно искать. Иначе ничего не выйдет. В очень упрощенной форме объясню, почему так происходит.
В литературе есть описание тысячи мутаций, которые характерны для разных генов человека. Фактически можно взять и выделить последовательность для начала и конца молекулы - это будут так называемые праймеры. Такие праймеры в большом количестве будут в двух пробирках.
Теперь нам нужно запустить реакцию ПЦР для нахождения мутаций.
Молекулу ДНК предварительно денатурируют, разрушая её водородные связи, и получая отдельные нити.
В специальный прибор - амплификатор добавляют клетки, праймеры и ДНК-полимеразу (специальное вещество, которое строит молекулу ДНК).
В приборе происходит реакция нагрева и охлаждения смеси, в результате чего на выходе получается нужный нам ген, содержащий мутацию. Или не содержащий. Увидеть его можно, например, с помощью электрофореза. На каплю смеси наносится специальный гель, который под воздействием электрического тока и ультрафиолета будет испускать свет различной интенсивности.
Но почему ПЦР не такой точный, как секвенирование?
Суть именно в тех самых праймерах. Их подбор ведётся для конкретного небольшого участка. Поэтому, увы, невозможно с помощью этого метода охватить даже половину известных мутаций генов.
Внизу иллюстрация охвата мутаций генов BRCA1/2 ПЦР методом.
Вернёмся к секвенированию.
Есть различные методы секвенирования, но принцип у них один. Копирование молекул, затем разрезание её на риды. А вот способы чтения последовательностей нуклеотидов будут отличаться.
Первым методом секвенирования стало секвенирование по Сэнгеру. Именно с его помощью был расшифрован геном человека.
Суть метода в многократном копировании участка ДНК и разделении её на 4 части. В каждую часть добавляется: ДНК-полимераза, последовательность из 4 нуклеотидов, праймеры и так называемые "ложные" нуклеотиды (для каждой из 4 частей последовательность ложных нуклеотидов будет своей). Ложные нуклеотиды прекращают реакцию копирования молекулы.
Таким образом, получается множество копий участка ДНК, которые всегда заканчиваются на одну и ту же букву. Методом сравнения участков определяется исходная последовательность.
Всё же метод имеет свои недостатки, связанные с тем, что последовательность из многократно повторяющейся буквы нуклеотида, будет сливаться в одну. Качество метода также падает после 700 выделенных элементов. Но всё же данный метод точнее, чем ПЦР, так как охватывает больше участков ДНК.
Возможно, вы слышали про NGS-секвенирование. Что же это такое?
Это современный метод секвенирования на аппарате Illumina. Сейчас он считается одним из самых точных методов определения мутаций генов.
Суть метода в следующем.
К каждому участку ридов добавляются специальные адаптеры (небольшие последовательности нуклеотидов). Полученная смесь помещается на специальную поверхность, на которой есть участки ДНК, которые могут соединяться с той известной последовательностью нуклеотидов. Таким образом, разные участки образуют небольшие мостики, "присасываясь" к разным местам поверхности.
Далее каждый такой участок многократно клонируют и разрушают водородные связи, выделяя нити ДНК.
Затем поверхность опускают в раствор, в котором находится ДНК-полимераза и специальные меченные нуклеотиды, которые останавливают процесс клонирования. Присоединяется не последовательность, а только один нуклеотид.
Далее с помощью флуоресцентной технологии разные участки фотографируют. Так узнают букву, с которой начинается последовательность нуклеотидов участка ДНК. Затем лишний меченный нуклеотид с помощью препаратов удаляется и процесс повторяют.
Минус данного метода в том, что участки ДНК намного меньше, чем в секвенировании по Сэнгеру. Ошибки накапливаются уже на 100 последовательности. Однако этот метод распространённый и дешевый.
Нужно сдавать кровь или образец опухоли?
Выбирая NGS-секвенирование важно помнить также о том, что клетки опухоли не всегда показательны для данных генетических тестов.
Ученые из университета Северной Каролины в Чапел-Хилле сравнили образцы крови и опухоли 752 пациентов. Оказалось, что вариативность наличия мутаций генов больше в клетках опухоли, чем в крови. С чем это связано – пока непонятно. Самый большой разброс значений был у опухоли яичников. Таким образом, генетические мутации лучше искать именно в крови.
