Что такое ИФА? Объясняем на пальцах.
Иммуноферментный анализ или по-другому ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) является методом иммунологического исследования биообразцов на основе анализа реакции «антитело-антиген» с последующей качественной, полуколичественной или количественной интерпретацией. Если проще, то это метод выполнения анализов, где определяются только те биовещества, у которых могут быть по структуре антитела или антигены (кстати, о них мы немного писали в статье про РИА), а определение и идентификация происходит на основе «возникновения» пар «антитело-антиген»: когда в биоматериал добавляются меченные антитела или антигены для того, чтобы образовались необходимые пары и после произвести оценка этих меченных пар. То есть грубо говоря, если вы хотите определить у себя наличие антител к SARS-CoV-2, то лаборатория возьмет вашу кровь, проведет реакцию, в ходе которой в вашу кровь добавят меченные антигены, которые должны будут «сцепиться» с вашими антителами – и если антитела в вашей крови есть, то реакция произойдет, пары «антитела-антигены» образуются и оборудование их считает.
Вообще такой принцип (детекция антител-антигенов) работает не только в ИФА: он действителен и для радиоиммунного (РИА), и для иммуноблоттинга, и для иммунохемилюминесцентного анализа (ИХЛА) – разница лишь в том, как считываются эти пары «антитело-антиген». И вот в основе ИФА лежит световой метод, где с помощью специальных датчиков производится оценка наличия и при необходимости количества пар «антитело-антиген» за счет измерения оптической плотности, то есть грубо говоря, насколько хорошо светится в реакционной лунке пары «антитело-антиген» – чем больше света, тем больше этих пар. Источником самого света являются меченные антитела или антигены, которые при стыковке с соответствующим антгеном или антителом начинают излучать свет.
Но это всего лишь метод, он сам по себе безобидный. А вот дьявол, как говорится, всегда таится в деталях.
В лабораторных кругах под ИФА уже давно принято называть отдел, где исследования выполняются ручными методиками с применением реагентов для ИФА. Причем самих реагентов на рынке масса, и все в принципе имеют схожий принцип идентификации с поправкой на чувствительность систем и применение различных дополнительных реакционных смесей – по сути почти всегда одно и тоже:
- Берется планшет, чаще всего размером 8х12 лунок
- От 2 до 8 лунок заполняют контрольными материалами (примером положительной или отрицательной пробы из набора реагентов), а так же калибраторами при необходимости
- И чаще всего, во все остальные лунки раскапывается биоматериал, туда же добавляется реагент и производится реакция
- После с плашки «смывают» не нужные биовещества: все, кроме образовавшихся пар «антител-антигенов»
- И далее вставляется в анализатор – ридер, который производит идентификацию и выдает результат
Так вот вся проблема в этих пресловутых планшетах! Почему? Да потому что, в большинстве случаев «раскапывают» их вручную, а где на огромных потоках замешаны руки - там велика вероятность ошибки. То есть буквально лаборанту необходимо взять порядка 90 пробирок и раскапать их в лунки на планшете, и при этом не ошибиться, не промахнуться и еще зафиксировать, какого пациента в какую лунку он раскапал. Более того, эти планшеты очень небольшие (примерно 8,5х12,7 сантимеров) и фактически не имеют маркировки (то есть нельзя визуально соотнести какому пациенту и к какому биоматериалу относится та или иная лунка, и физически их особо не промаркируешь). Поэтому если нет автоматизированных систем, которые заменяют руки, или вспомогательных систем, которые подсказывают лаборанту из какой пробирки в какую лунку нужно раскапать биоматериал – вероятность ошибиться довольно быстро растет от нуля. А теперь представьте, если вы сдавали на антитела IgM к SARS-CoV-2 методом ИФА или на антитела+антигены к ВИЧ и не дай Бог вас перепутали? Какая цена ошибки?
Это самая большая и популярная «страшилка», но у хорошей лаборатории на нее всегда есть ответ и рабочее решение:
- Как мы говорили – это полностью автоматизированные линейки ИФА анализаторов: Tecan, Hamilton или даже российский Вектор-Бест на основе иностранных комплектующих делает автоматизированные приборы, которые раскапывают и даже делают детекцию (саму реакцию, то есть анализ)
- Виртуальные помощники, которые подсвечивают лаборанту пробирки и лунки, а также фиксируют в информационной системе какой пациент к какой лунке относится
- Повторная валидация – многие крупные лаборатории в случае получения положительного результата перепроверяют его 1 или еще 2 раза. И если произойдет расхождение, то весь планшет переделают.
Да и в целом, почему в век, когда в лабораториях работают разве что не роботы, когда есть масса автоматизированных решений – все еще популярен и развивается ИФА как ручной метод? Если отбросить сценарий небольших лабораторий, для которых ИФА – единственный способ выживать, то ответ очень простой:
- На ИФА чаще всего выполняются не потоковые и экзотические исследования (примерно от 1 до 5 планшетов в день), так как их либо экономически невыгодно делать на автоматических анализаторах, либо их там просто нет (например, сперва в России появились ИФА наборы на определение антител к SARS-CoV-2, прежде чем они появились на анализаторах)
- ИФА может входить в стандарт диагностики, так, например, в стандартах прописано, что исследование на Гепатит С всегда должно выполнять на разных методиках и обязательно проверяться на ИФА (СПЕКТР)
- ИФА может использоваться для массовых профосмотровых исследований, когда в лабораторию напрямую или через подрядчика обращается крупная организация (например, Аэрофлот) для диагностики всего летного состава и офиса на ВИЧ, Сифилис, Гепатит B и C (так называемая «госпитальная четверка»), но платить много не хочет, так как это не их прихоть, а законодательное требование. Поэтому в ход идут недорогие наборы ИФА, которые еще могут быть комбинированными, когда один реагент делает детекцию сразу нескольких инфекций: и вот на госпитальную четверку как раз компания Диагностический Стандарт имеет один набор на все 4 инфекции – либо все чисто, либо одна из инфекций в организме есть, но какая – нужно диагностировать дальше раздельно
Поэтому не стоит бояться и недооценивать ИФА, тем более, что если в лаборатории все процессы налажены верно, то вероятность ошибки такая же, как на анализаторах. А если учесть, что ИФА чисто технически проще в разработке и производстве, то это спасительная палочка-выручалочка в период эпидемий, так как позволяет быстро создать и тиражировать тест-системы для всех лабораторий.
На этом у нас все, но это не точно…)
Будьте здоровы!
