Бесплодие -заболевание, определяемое как неспособность достичь клинической беременности после 1 года регулярных незащищенных половых актов, затрагивает 12-15% пар репродуктивного возраста во всем мире. Даже после 2 лет около 10% пар все еще не могут достичь естественного зачатия. У таких пар часто для достижения беременности необходмо использовать методы ВРТ. Исторически женщина была в центре внимания при оценке потенциала фертильности и последующего супружеского бесплодия. Мужскому фактору бесплодия в настоящее время уделяется больше внимания связывая с ним до 50% причин бесплодия (практический комитет американского общества репродуктивной медицины, 2015). Следовательно, необходимо усовершенствовать методы отбора сперматозоидов, чтобы получить клетки, способные оплодотворять яйцеклетку и генерировать эмбрион, обладающий высоким потенциалом, приводящим к рождению здорового потомства. Из-за неоднородности популяции сперматозоидов, а также наличия загрязняющих круглых клеток, лейкоцитов и мертвых или измененных сперматозоидов необработанный эякулят первоначально обрабатывается с целью отбора подвижных, жизнеспособных сперматозоидов (ВОЗ, 2010). Современные методы в основном зависят от осаждения или миграции сперматозоидов, которые разделяют популяции сперматозоидов на основе их подвижности или плотности; Однако другие клеточные и молекулярные характеристики, такие как целостность ДНК сперматозоидов, не учитываются при отборе. Особую озабоченность вызывает тот факт, что некоторые исследования показывают, что центрифуга с прерывистым градиентом плотности, наиболее часто используемый метод отбора сперматозоидов, может увеличить фрагментацию ДНК сперматозоидов, которая связана с негативными исходами лечения бесплодия и беременности;
Сперматозоиды морфологически сильно отличаются от своих первичных половых клеток: они представляют собой полярную клетку со жгутиком для подвижности, головкой с сильно конденсированной ДНК и акросомой, которая содержит необходимые ферменты для оплодотворения. на протяжении всего этого процесса сперматогониальные зародышевые клетки поддерживаются в тесном контакте с клетками Сертоли, которые не только обеспечивают их необходимыми питательными веществами, но и действуют как "селекторы", так что только сперматозоиды с нормальными характеристиками (например, морфологическое созревание) способны к оплодотворению. Хотя эти механизмы необходимы для получения сперматозоидов с нормальными морфологическими особенностями и нефрагментированной ДНК, нередко аномальные сперматозоиды попадают в просвет семенных канальцев, что может ухудшить фертильность, поскольку нормальное эмбриональное развитие зависит от доставки неповрежденного генетического материала в яйцеклетку. На заключительных стадиях сперматогенеза ядерная ДНК уплотняется основными протаминами, что делает их ДНК инертной и неспособной реагировать на факторы окружающей среды посредством экспрессии генов. Эти механизмы предотвращают фрагментацию ДНК; Однако внутренние и внешние факторы, все еще могут приводить к повреждению ДНК:
➡️дефекты рекомбинации во время сперматогенеза;
➡️аномальное созревание сперматид;
➡️изменение соотношения протамина 1 и 2;
➡️абортивный апоптоз;
➡️окислительный стресс
➡️промежуток времени после эякуляции;
➡️температура хранения и криоконсервация;
➡️посттестикулярный окислительный стресс
➡️варикоцеле
➡️методы подготовки спермы для ВРТ
ДНК фрагментация является многофакторным маркером фертильности и может негативно повлиять как на естественное зачатие, так и на результаты ВРТ.
Все это свидетельствуют о том, что разработка методов отбора, направленных на удаление сперматозоидов с поврежденной ДНК, особенно важна. В ходе попытки лучше понять молекулярные механизмы проведен анализ белков сперматозоидов в образцах с высокой и низкой нативной ДНК фрагментацией. Особенно обратило на себя внимание повышение эпидидимального сперматозоид-связывающий белка i (elspbpi, uniprot ac: q96bh3) в образцах с высоким содержанием фрагментации ДНК.
Предыдущие исследования, в котором отбирались жизнеспособные сперматозоиды методом центрифугирования в градиенте плотности, показали, что этот же белок, а именно elspbpi, повышен в жизнеспособных сперматозоидах пациентов с высокой ДНК фрагментацией. Это привело к предположению, что elspbpi избирательно связывается со сперматозоидами с высокой фрагментацией ДНК.
Данное исследование включало три эксперимента с использованием образцов спермы человека.
✅в эксперименте 1 elspbpi измеряли в семенной плазме и в сперме образцов с высокой и низкой ДНК фрагментацией.
✅в эксперименте 2 местоположение elspbpi определяли на сперме человека.
✅в эксперименте 3 elspbpi-положительные сперматозоиды были отделены от elspbpi-отрицательных сперматозоидов, и были определены уровни фрагментации ДНК этих двух субпопуляций.
В общей сложности было набрано 267 добровольцев в возрасте от 20 до 50 лет. Из исследования исключены 134 образца от пациентов, которые сообщили о лихорадке в течение 90 дней до исследования, у которых в анамнезе были системные заболевания, изменения или хирургические вмешательства (врожденный порок развития половых органов, пахово-мошоночная хирургия, орхит, крипторхизм и другие), а также те, кто сообщил об употреблении сигарет или других наркотиков. Образцы спермы отбирали путем мастурбации после 2-5 дней воздержания и оценивали в соответствии с руководящими принципами Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 2010).
💠Популяция elspbpi (-), не меченная антителом, показала меньшую фрагментацию ДНК. Иммуномагнитное разделение сперматозоидов с использованием антител против белков, связанных с апоптотическими процессами показало свою эффективность, что позволило отобрать сперматозоиды с лучшим общим качеством
💠При сравнении прогрессивной подвижности необработанного образца по сравнению с двумя подгруппами elspbpi(+)/ elspbpi(-), существенной разницы не наблюдалось, демонстрируя, что предложенный в исследовании метод отбора не вызывает негативных изменений в сперматозоидах с точки зрения подвижности. Также показательно, что подвижность была такой же высокой в образце с высокой фрагментацией ДНК, демонстрируя, что отбор по подвижности не влияет на целостность ДНК.
💠Кроме того, также важно удалять сперматозоиды с фрагментированной ДНК из здоровой популяции, при проведении ВРТ, с особым акцентом на ИКСИ, т.к. измененные сперматозоиды потенциально могут быть введены в яйцеклетки. Обычно яйцеклетка восстанавливает повреждения ДНК, но этот процесс может быть неполноценным, в результате чего генетические мутации в эмбрионе могут повлиять на его жизнеспособность и здоровье потомства. Способность яйцеклетки восстанавливать отцовскую ДНК изменяется под влиянием нескольких факторов, включая возраст матери и использование препаратов для индукции овуляции. Таким образом, удаление сперматозоидов с высокой фрагментацией ДНК не только улучшило бы результаты, но и повысило бы безопасность ВРТ у мужчин с высокой фрагментацией.
💠elspbpi повышен в сперме, но не в плазме крови, у мужчин с высокой ДНК фрагментацией,
💠elspbpi в основном локализован в головке сперматозоида, а elspbpi(+) - сперматозоиды имеют более высокую фрагментацию ДНК, следовательно результаты можно однозначно связать с присутствием elspbpi на мембране.
Модель CART, используемая в данном исследовании, установила пороговое значение для низкой и высокой ДНК фрагментации.
✅Используя этот порог, 95% сперматозоидов в популяции elspbpi (-) были бы классифицированы как с низкой фрагментацией ДНК;
✅аналогично elspbpi (+) представлял более 80% сперматозоидов с высокой фрагментацией днк.
Ожидается, что использование такой системы повысит безопасность ВРТ, и ИКСИ в частности, за счет снижения вероятности введения сперматозоидов с фрагментацией ДНК.
