Мембранные белки частично погружены в липидный бислой, а частично выступают в воду. Новые методы электронной микроскопии дают возможность понять, какие особенности структуры этих белков позволяют им существовать в двух столь различных средах одновременно.
Вступление
Все клетки и различные органеллы внутри них окружены очень тонкими, но необычайно прочными пленками, состоящими из липидов и белков, — биологическими мембранами.
Основная функция мембран — создание непроницаемого для многих веществ барьера между клеткой и внешней средой или между различными отсеками внутри клетки, благодаря чему содержимое их не смешивается и в живой клетке поддерживается стройная система химических процессов.
Однако биологические мембраны — это не просто перегородки, они служат высоко специфичными посредниками между клеткой и средой или между органеллами и их окружением.
Для того чтобы понять, как работают мембранные белки, необходимо знать, какова их трехмерная структура и как она изменяется в ответ на те или иные внешние стимулы. Мы исследовали структуру мембранных белков с помощью электронного микроскопа. Это позволило выяснить некоторые важные детали.
Липиды и белки
Основой биологической мембраны является бимолекулярный слой липидов. Липидная молекула амфифильная, т.е. часть ее гидрофильна, а часть гидрофобна.
«Голова» молекулы гидрофильна: она легко взаимодействует с водой, образуя с ней водородные связи. Два длинных углеводородных «хвоста» молекулы гидрофобны: они неспособны образовывать водородные связи и не имеют сродства к воде.
В физиологических условиях в водной среде такие молекулы стремятся образовать бислойную мембрану. Их гидрофильные головы при этом образуют поверхность мембраны и взаимодействуют с водным окружением — межклеточной средой, цитоплазмой или матриксом органелл, а гидрофобные хвосты взаимодействуют друг с другом внутри бислоя.
Молекулы липидов находятся в постоянном тепловом движении и могут перемещаться в плоскости мембраны. Таким образом, липидный бислой представляет собой по существу двумерную пленку жидкости, лишь немного более вязкой, чем вода. Несмотря на малую толщину и свойства жидкости, бислой очень стабилен, так как амфифильные молекулы липидов собраны в нем в наиболее энергетически выгодную структуру.
Мембранные белки плотно встраиваются между липидными молекулами бислоя. Они могут быть разбросаны в мембране по одной или же образовывать скопления.
Как ни разнообразны мембранные белки, все они отличаются от водорастворимых тем, что одновременно контактируют с двумя различными средами — липидным слоем и водой (часто мембранный белок насквозь пронзает бислой и соприкасается с водной фазой по обе стороны от него), т.е. находятся на границе раздела фаз.
Альфа-спираль и Бета-структура
В большинстве исследованных водорастворимых белков более или менее упорядоченные участки полипептидной цепи — Альфа-спирали или Бета-структуры — чередуются с менее упорядоченными.
Альфа-Спираль представляет собой жесткую стержне образную структуру: полипептидный остов, скрученный в плотную спираль, образует цилиндр, из которого выступают наружу боковые цепи аминокислот.
В Бета-структуре, напротив, две или несколько полипептидных цепей почти полностью растянуты и расположены параллельно друг другу, так что боковые цепи аминокислот выступают перпендикулярно образовавшемуся слою по обе его стороны.
Как Альфа-спираль, так и Бета-структура стабилизируются водородными связями между гидрофильными группами NH и CO, образующими остов полипептидной цепи. В Альфа-Спирали связи образуются между группами в соседних витках одной и той же цепи, а в Бета-структуре — между группами разных (соседних) цепей.
Электронно Микроскопический анализ
Много лет назад ученые решили исследовать структуру мембранных белков с помощью электронного микроскопа по методике, разработанной для рентгеноструктурного анализа кристаллов растворимых белков.
Всякий кристалл состоит из множества одинаковых молекул, расположенных строго регулярно. Положение и ориентация каждой молекулы зависят от ее структуры. В целом кристалл представляет собой совокупность повторяющихся элементарных ячеек.
Изучая дифракцию рентгеновских лучей на кристалле, можно получить информацию о расположении атомов в отдельных молекулах, образующих кристалл. Большая часть данных о структуре растворимых белков, включая детали строения Альфа-Спирали и Бета-Структуры, была получена именно с помощью рентгеновского дифракционного анализа крупных трехмерных белковых кристаллов.
Провести аналогичное исследование мембранных белков было невозможно, поскольку не удавалось получить их трехмерные кристаллы. Эти белки приспособлены к существованию в двумерном пространстве липидного бислоя и склонны образовывать двумерные, а не трехмерные агрегаты.
Некоторые мембранные белки в природных мембранах существуют в виде двумерных решеток, которые по существу являются двумерными кристаллами. Другие белки можно заставить образовывать подобные структуры. Для этого белки экстрагируют из мембраны с помощью детергента, очищают и реконструируют с добавленным в определенной пропорции липидом.
Рентгеновские лучи, проходя через такие тонкие кристаллы.практически не рассеиваются, но электроны, которые способны взаимодействовать с ядрами атомов, рассеиваются значительно сильнее и дают дифракционные картины.
Более того, поскольку электроны — это заряженные частицы, их поток можно сфокусировать и получить изображение объекта — электронную микрофотографию. Такое изображение несет даже большую информацию о структуре отдельной молекулы, чем дифракционная картина.
Фурье-преобразование
Один из способов добиться усиления (усреднения) изображения заключается в том, что повторные изображения накладываются одно на другое, так что повторяющаяся информация суммируется.
Этот путь, однако, может не дать положительного результата, так как часто трудно установить точное расположение повторяющихся элементов. Более эффективен остроумный подход, разработанный несколько лет назад Д. Де Розье и А. Клугом (лаборатория молекулярной биологии Совета медицинских исследований в Кембридже) для анализа электронных микрофотографий таких упорядоченных агрегатов, как вирусные частицы. По их методу усреднение происходит в несколько этапов.
Первый шаг — сканирование фотографий кристаллического объекта с помощью микроденситометра, которое дает двумерный массив чисел, соответствующих электронной плотности в каждой точке изображения.
Вторая стадия — фурье-преобразование полученной решетки, что дает численный аналог дифракционной картины.
На третьем этапе из преобразованных данных отбирают информацию о повторяющихся элементах образца.
И наконец, реконструируют изображение объекта, для чего проводится второе фурье-преобразование — фурье-синтез, который позволяет получить изображение без шума.
Бактериородопсин
Описанные выше методы применили для изучения структуры бактериородопсина — относительно простого белка, обнаруженного в клеточной мембране галобактерий.
Эти бактерии могут жить только при очень высокой концентрации хлорида натрия; в природе они встречаются в соленых озерах и в пересыхающих прудах.
Бактериородопсин состоит из 248 аминокислот и содержит связанную молекулу ретиналя.
Ретиналь — светочувствительный компонент зрительных пигментов животных; он входит в состав родопсина — «зрительного пурпура», который находится в клетках-палочках сетчатки человеческого глаза.
В мембране галобактерий бактериородопсин функционирует как светозависимая протонная помпа, с помощью которой осуществляется особый бесхлорофильный тип фотосинтеза.
Бактериородопсин обладает удивительной способностью к агрегации в мембране. Он образует кристаллические «бляшки», состоящие из десятков тысяч молекул белка и сотен тысяч молекул липидов, упакованных в плотную гексагональную решетку. Эти «бляшки» легко выделить и суспендировать в присутствии глюкозы, что делает возможным прямые исследования.
Трехмерная структура
Де Розье и Клуг сформулировали общие принципы получения трехмерной структуры биологической молекулы по ее двумерным проекциям. В оптическом стереомикроскопе каждый глаз наблюдателя рассматривает объект под своим углом наклона, а в мозгу из двух плоских изображений создается единый трехмерный образ.
С помощью электронного микроскопа тоже можно сделать две фотографии объекта под разными углами и рассматривать их затем через стерео приставку. Этот способ, однако, не позволяет получить нужного количества деталей для точной трехмерной реконструкции объекта.
Из теории Фурье следует, что подобная реконструкция возможна, если имеется не два, а серия двумерных изображений, полученных при немного различающихся углах. Каждое из них может быть подвергнуто фурье-преобразованию и затем «отфильтровано» от шума. Члены ряда Фурье для всех проекций в сумме составляют трехмерный набор. Последующая операция фурье-синтеза дает трехмерную реконструкцию объекта.
Чтобы построить точное трехмерное изображение, следовало получить электронные микрофотографии пурпурной мембраны при углах наклона от 0 до 90°. Сделать это было невозможно, но, перемещая образец так, чтобы каждый раз фотографировалась новая бляшка, не пострадавшая от электронного пучка, нам удалось получить 18 снимков для углов от 0 до 57°.
Фурье-преобразование этих изображений дало амплитуды и фазы трехмерного набора членов ряда Фурье. Чтобы точнее определить амплитуды, мы получили также 15 картин дифракции электронов, соответствующих разным углам наклона. Мы объединили данные этих двух методов, обработали их с помощью фурье-синтеза и построили 10 контурных карт, каждая из которых соответствовала «разрезу» на той или иной «глубине» мембраны.
