Действие происходит в 480 году до н. э. в Древней Греции. В Спарте, городе воинов, правит царь Леонид. К нему прибывает посол могущественного персидского царя Ксеркса. Посол требует от греков «землю и воду» — символическое признание подчинения Персии. В ответ гордые спартанцы сбрасывают посла и персов в колодец («Это Спарта!»).
Ксеркс, именующий себя «Богом-Королём», собирает гигантскую армию, чтобы наказать непокорных греков и завоевать всю Европу. Узнав о нашествии, совет старейшин Спарты отказывает Леониду в объявлении войны из-за религиозного праздника. Царь понимает, что промедление смерти подобно, и решает действовать вопреки закону.
Леонид собирает 300 своих лучших воинов — личную гвардию, известную как «эфебы» (хотя в фильме их называют спартанцами). Это не просто солдаты, а элита, с детства воспитанная для войны. По пути к ним присоединяется отряд из 700 феспийцев во главе с Дилеосом.
Отряд Леонида отправляется к узкому горному проходу Фермопилам («Горячие ворота»). Это идеальное место для обороны: персы не смогут использовать своё численное превосходство. Здесь спартанцы строят стену из щитов и камней, готовясь к встрече с врагом.
Ксеркс отправляет на переговоры своего эмиссара, который предлагает Леониду сдаться и стать самым богатым человеком в Греции. Леонид отвечает отказом.
Начинается битва. Персы посылают в бой «бессмертных» — элитную гвардию Ксеркса. Спартанцы встречают их плотным строем (фалангой) и легко побеждают благодаря дисциплине и тяжелым доспехам. Затем Ксеркс бросает в бой «чудовищ» — боевых слонов и носорога, но и они не могут сломить строй греков.
В стане спартанцев находится Эфиальт — горбун, мечтающий стать воином. Он предаёт Леонида, показав персам тайную горную тропу в обход Фермопил, в обмен на обещанные дары и любовь женщин.
Леонид узнаёт о предательстве. Понимая, что их окружили, он отпускает союзников-феспийцев и фиванцев. С ним остаются только 300 спартанцев.
В последней битве спартанцы сражаются с невероятной яростью. Леонид погибает от стрелы персидского лучника. Его тело защищают до последнего. Оставшиеся в живых воины, включая Дилеоса, бросаются в последнюю самоубийственную атаку на Ксеркса.
Фильм заканчивается тем, что выживший Дилеос отправляется в другие греческие города (Афины, Коринф), чтобы рассказать о подвиге 300 спартанцев. Его рассказ вдохновляет всю Грецию на объединение против общего врага.
Заключительный титр гласит: «Хотя битва была проиграна, война только началась. И вскоре великий город-государство Афины соберёт самую большую армию в истории Греции, окончательно разбив персов при Платеях и сохранив зарождение демократии».
Фильм является стилизованной экранизацией одноимённого комикса Фрэнка Миллера, который, в свою очередь, основан на реальных исторических событиях. Он прославляет мужество, самопожертвование и воинскую доблесть.