В ландшафт раковых клеток сложности (казалось бы, куда больше?) добавляет эпигенетика — система генетического контроля, лежащая «поверх» генетики (с греческого «эпи-» — поверх, над): изменения в работе генов, не связанные с изменением последовательности ДНК. В случае злокачественных опухолей правильнее дополнить: «не связанные с изменением в их последовательности ДНК», потому что мутации всё же присутствуют.
«Биомолекула» выпускала Спецпроект по эпигенетике, куда мы и направляем читателей, чтобы познакомиться с этой концепцией подробнее: «Молекулы и эпигеном», а также «Эпигеном: параллельная реальность внутри клетки».
Эпигенетические изменения могут влиять на развитие клеток, их дифференцировку, адаптацию к сигналам окружающей среды, системы общения с соседними и отдаленными клеткам (паракринные и эндокринные сигналы).
В случае злокачественной трансформации эпигенетика вторична по отношению к генетическим нарушениям. Однако, постойте. Теоретически возможен эпигенетически спровоцированный рак: метилирование ДНК или транскрипция некодирующих РНК подавляет экспрессию онкосупрессоров — накопление мутаций уже вторично. Было показано, что гиперметилирование промотора p16 приводило к более раннему развитию спонтанных опухолей у мышей. А репрессия ремоделлера хроматина из семейства Polycomb привела к развитию исключительно эпигенетически спровоцированного рака у дрозофилы. Однако это искусственно созданные «в тепличных условиях» опухоли.
Есть три базовых варианта взаимовлияния генетики и эпигенетики на рост и развитие опухоли:
- Мутантные факторы транскрипции привлекают кофакторы (активаторы и репрессоры), факторы ремоделирования хроматина и другие белковые комплексы, перестраивающие укладку хроматина и меняющие паттерны экспрессии генов.
- Мутации в генах факторов ремоделинга хроматина ведут к тому, что они изменяют свою активность или работают менее специфично.
- Мутации в регуляторных последовательностях генов не дают факторам транскрипции с ними связаться и так нарушают программы их экспрессии.
Недавно группа из Южной Кореи обнаружила три регуляторных фактора: гистон деацетилазу (HDAC2) и два ФТ: MYB и FOXA2, ингибирование которых позволило дифференцировать опухолевые клетки колоректального рака в нормальные энтероциты. Это открытие открывает новые перспективы разработки эпигенетической терапии рака.
Эпигенетические нарушения —
Характерная черта всех видов рака у человека, включая аномальное метилирование/деметилирование ДНК, модификации гистонов и активность некодирующих РНК. Это имеет глобальный эффект: дедифференцировка опухолевых клеток, их инвазивность, моделирование опухолевого микроокружения (особенно взаимодействия с фибробластами и клетками иммунной системы), секреция аномальных белков. Долгое время альфа-фетопротеин (AFP) использовался как биомаркер гепатоцеллюлярной карциномы (один из видов рака печени): в норме AFP экспрессируется в эмбриональной стадии развития, его количество максимально на 9–14 неделе и постепенно падает, резко снижаясь до нуля сразу после рождения. Его функция та же, что у сывороточного альбумина взрослых, но кроме как у беременных, его в крови быть не должно. Поэтому AFP долгое время был чуть ли не единственным диагностическим маркером ГЦК, хотя и не отвечает всем требованиям хорошего онкомаркера.
У опухолевых клеток есть свой аномальный паттерн метилирования: общее гипометилирование и локальное гиперметилирование промоторов. Гипометилирование играет двойную роль: повышает экспрессию онкогенов и создает характерные особенности каждой опухоли, в некоторой степени определяет ее агрессивность, способность к адаптации. Гиперметилирование промоторов снижает экспрессию генов-онкосупрессоров, например, онкосупрессора WT1 при карциноме молочной железы, глиобластоме, раке предстательной железы и многих других.
В раке поломано всё, и порой не на пользу опухоли — метилирование ДНК в области промотра гена IDO1 коррелирует с лучшими показателями выживаемости пациентов. Почему? IDO1 превращает триптофан в кинуренин, и высокая экспрессия IDO1 повышает кинуренин в микроокружении опухоли. Триптофан важен для сильного и качественного Т-клеточного ответа, а вот кинуренин — это лиганд для рецептора AhR, и его сигнал повышает экспрессию PD-1 на CD8+ Т-клетках и способствует дифференцировке CD4+ Т-хелперов в иммунносупрессивные Т-регуляторные клетки. Иными словами, заставляет иммунную систему смотреть на опухоль сквозь пальцы.
Второй эпигенетический механизм, который нарушается в злокачественных клетках — модификации гистонов. В зависимости от того, какой аминокислотный остаток и как модифицирован (метилирован или ацетилирован), хроматин либо приобретает более открытый, «рыхлый» вид, либо наоборот — конденсированный, закрытый . В первом случае это способствует экспрессии, а втором блокирует ее. В общем смысле эффект тот же — ФТ, медиаторный комплекс и вся машинерия экспрессии просто не может взаимодействовать с ДНК. Как и многое другое в сложном мире живой клетки, модификации гистонов связаны с циклом Кребса — оттуда берутся необходимые метаболиты и коферменты, доноры для метилирования, фосфорилирования или ацетилирования гистонов.
Подробнее это явление, названное «гистоновым кодом», разобрано в статье «Молекулы и эпигеном» .
Например, гистонметилтрансфераза DOT1L играет важную роль в формировании популяции раковых стволовых клеток в трижды негативном раке молочной железы. А метилтрансферазы EHMT1 и EHMT2, которые метилируют (и диметилируют) гистон 3 по 9 остатку (лизин) способствуют эпиталиально-мезенхимальному переходу — способности клеток открепляться от внеклеточного матрикса и соседних клеток, приобретать подвижность и избегать аноикис. Впрочем, это далеко не единственное свойство раковых клеток, развитию которого способствуют эти две метилтрансферазы.
Метилирование гистонов имеет двоякие последствия — в зависимости от того, на каком остатке лизина модификация, это будет расслаблять или компактизировать хроматин. Ацетилирование всегда снижает положительный заряд гистонов и способствует расслаблению хроматина. А гистон деацетилазы (семья белков HDAC) делают архитектуру хроматина более компактной. В зависимости от того, насколько тяжело мутационное бремя, изменения к экспрессии, спровоцированные модификацией гистонов, могут быть глобальными, и приобретаемый клетками фенотип может характеризоваться инвазивностью, метастазированием, ангиогенезом, дедифференцировкой. Уровень ацетилирования гистонов может служить прогностическим маркером при диагностике, и эта тема активно изучается в настоящее время.
В условиях не терминально дифференцированных клеток, или дедифференцированных раковых клеток эффект сниженного ацетилирования гистонов может быть спровоцирован хорошо известным признаком ракового метаболизма — эффектом Варбурга: менее эффективным гликолизом с образованием молочной кислоты. Это снижает конвертацию пирувата в ацетил-КоА и цитрат, который потом мог бы быть вновь обращен в ацетил-КоА и стать донором для ацетилирования гистонов.
Обеднение цикла Кребса происходит еще за счет изъятия метаболитов из метаболического пути для побочных процессов. Промежуточные продукты обмена идут на синтез жирных и аминокислот — строительных блоков новых клеток.
Это не единственный пример метаболической регуляции эпигенетики. Опухоль — это не только трансформированные клетки. Это еще фибробласты, клетки иммунной системы, эндотелиальные клетки сосудов, внеклеточный матрикс... Всё это находится в постоянном общении, и по мере роста опухоли ее метаболизм претерпевает серьезные изменения, а следом и всё микроокружение попадает под эти климатические перемены. Об изменениях в микроокружении опухоли мы подробно поговорим в следующих статьях цикла.
При гепатоцеллюлярной карциноме, в отличие от опухолей кишечника, легких, кожи, обе изорформы фосфоенолпируват карбоксилазы (PCK1 и PCK2) экспрессируются на существенно более низком уровне. Высокая экспрессия этих генов связана с более агрессивной пролиферацией клеток, но при ГЦК низкая экспрессия является маркером неблагоприятного прогноза. Почему в печени всё наоборот? При высокой экспрессии цитоплазматическая (PCK1) и митохондриальная (PCK2) изоформы ведут к повышенному катаплерозу — в итоге цикл Кребса просто задыхается, не начавшись: в условиях дефицита глюкозы это ведет к энергетическому кризису и апоптозу.
В исследовании рака поджелудочной железы оказалось, что глутамин помогает раковым клеткам избегать апоптоза. Цепочка событий такова: глутамин в два шага превращается в ɑ-кетоглутарат, а тот, в свою очередь, необходим для активности лизин-специфической деметилазы KDM4C. Деметилаза снимает репрессивное метилирование H3K9 (гистон 3, лизин 9) в области гена, кодирующего белок c-FLIP. Этот белок структурно похож на каспазу-8, но, связываясь с ней, он ингибирует апоптоз.
Самая загадочная область в изучении эпигенетики онкологических заболеваний — модификации длинных некодирующих РНК. Некодирующих РНК экспрессируется очень много. Львиная доля — это рибосомные и сплайсосомные РНК, но есть множество других, и что они делают — совершенно непонятно. Многие обладают регуляторной функцией, служат медиаторами в метилировании ДНК, участвуют в модификации гистонов или метаболизме глюкозы. Экспрессируются в большей степени тканеспецифично, чем белки. Они подвергаются модификациям и имеют своих «писателей», «читателей» и «стирателей», то есть тех, кто добавляет модификацию, реагирует на нее и снимает. Известно, что экспрессия или, наоборот, отсутствие экспрессии неких длинных некодирующих РНК ассоциированы с злокачественными опухолями и даже могут быть использованы как диагностические маркеры.
Больше о генетических (и эпигенетических) причинах развития раковых опухолей, читайте в нашей новой статье!