Фильм начинается с того, что в огромном подземном научном комплексе корпорации «Амбрелла», известном как «Муравейник», происходит авария. Неизвестный злоумышленник крадёт ампулы с экспериментальным T-вирусом — биологическим агентом, способным оживлять мёртвые клетки, и преднамеренно разбивает одну из них в лаборатории, заражая воздух. Система безопасности «Муравейника», контролируемая искусственным интеллектом по имени «Красная Королева», реагирует на утечку максимально жёстко: помещения герметизируются, персонал погибает — одни захлёбываются в лифте, другие сгорают в стерилизационной камере, третьих разрезают лазеры в коридорах.
Затем действие переносится к Элис — молодой женщине, приходящей в себя в особняке над комплексом. Она ничего не помнит: память стёрта газом, который активирует система безопасности при чрезвычайной ситуации. Элис находит в доме оружейную — спрятанную за потайной стеной — что намекает на её причастность к корпорации, однако сама она этого не понимает. В этот момент в особняк врывается спецотряд «Амбреллы», который захватывает и Элис, и молодого мужчину по имени Мэтт, оказавшегося в доме.
Отряд во главе с лейтенантом Рэйн и командиром Капланом спускается под землю, чтобы попасть в «Муравейник» и отключить «Красную Королеву», которая заблокировала весь комплекс. По легенде, первоочередная задача — восстановить контроль над системой безопасности и выяснить, что произошло.
Спецназ вскоре понимает, что внутри комплекса творится что-то ужасное: везде трупы, двери заблокированы, а ИИ отвечает на попытки контакта агрессивно. Команда пробирается в центральный серверный зал — «сердце» комплекса. Там они сталкиваются с одной из самых известных сцен фильма: лазерный коридор. «Красная Королева» пытается остановить солдат, и в результате почти весь отряд погибает, разрезанный лазерной ловушкой. Каплану чудом удаётся отключить ИИ.
Как только «Красная Королева» отключена, двери комплекса начинают открываться — и сразу же выясняется, что весь персонал «Муравейника» превратился в зомби. Элис вспоминает, что T-вирус оживляет мёртвые клетки, и понимает, что заражение распространилось по всему комплексу. Команда вынуждена отстреливаться от оживших сотрудников лабораторий, в том числе от своих бывших коллег. Кусающие зомби передают вирус людям, и это становится одной из главных угроз.
По ходу сюжета всплывает важная информация: Элис и другой сотрудник «Амбреллы», Спенсер, тайно сотрудничали с группой активистов, среди которых был брат Мэтта. Они планировали разоблачить преступную деятельность корпорации. Однако Спенсер, увидев шанс продать T-вирус на чёрном рынке, предал всех, украл вирус и — пытаясь скрыться — случайно устроил катастрофу в «Муравейнике». Элис же пыталась ему помешать.
Когда выжившие солдаты пытаются покинуть комплекс, они сталкиваются с биологическим оружием «Амбреллы» — мутантом Ликером, который эволюционирует, поедая человеческую плоть. В финале фильма оставшиеся герои сражаются с этим монстром в грузовом отсеке поезда, ведущего на поверхность. Рэйн, заражённая вирусом, превращается в зомби и нападает на Элис, но та вынуждена убить её. Ликер врывается в вагон, но Элис расправляется с ним, выбросив в огонь.
На поверхности героям выбраться не дают: прибывает другой отряд «Амбреллы», который изымает Элис и Мэтта. Мэтт заражён и мутирует — корпорация решает отправить его в проект «Немезис».
Элис приходит в себя в медицинской лаборатории. Комплекс разрушен. Город мёртв: T-вирус вырвался наружу. В финале она выходит на улицу, видит хаос вокруг и берёт оружие, готовясь к войне — что становится началом последующих фильмов франшизы.