Сегодня мы с вами разберем статью, опубликованную в журнале Acta Naturae в 2016 году (Женило С. В., Соколов А. С., Прохорчук Е. Б. Эпигенетика древней ДНК // Acta Naturae (русскоязычная версия). 2016. №3 (30). С. 80–84).
Прежде всего расскажу, что именно следует ожидать и чего не следует ожидать в журнальном клубе для олимпиадников по биологии. Статья для разбора у нас прежде всего служит для того, чтобы от нее "оттолкнуться" и заглянуть поглубже в те разделы, которые упоминаются в статье, и которые будут важны школьникам для понимания содержания статьи. А то, чего не следует ожидать - это критического разбора.
Поэтому первое, с чего мы начнем, – это с понятий, которые нам встретятся в статье (список не исчерпывающий, я здесь добавляю то, что, на мой взгляд, может быть интересно/непонятно/неизвестно будущим или нынешним олимпиадникам).
Список терминов
Общие понятия
Эпигенетика – это раздел генетики, который изучает особенности экспрессии генов без изменения нуклеотидной последовательности ДНК. Обычно в эпигенетике учитываются влияние питания, образа жизни, стресса и других факторов внешней среды на изменения фенотипа организма.
Метилирование ДНК - это один из эпигенетических механизмов. Присоединение метильной группы к цитозину (см. MpG) в промоторе гена "выключает" его. Если убрать метильную группу, то ген активируется.
Гистоновый код (по аналогии с генетическим кодом) - предположение о том, что посттрансляционная модификация гистонов (белков, с которыми связывается ДНК для образования нуклеосомы) может влиять на экспрессию генов через их "включение" и "выключение", делая ДНК доступной или недоступной для ферментов, которые будут транскрибировать участок ДНК.
Древняя ДНК - ДНК, выделенная из обнаруженных останков (неандертальцев, денисовского человека, мамонтов и проч.). Анализ структуры древней ДНК позволил в свое время установить степень родства современного человека с древними людьми. Определение последовательности древней ДНК, а также ее метилирования, сопряжено с целым рядом технических сложностей. Однако, эти сложности были решены, за что Паабо получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2022 году.
микроРНК - это короткие некодирующие последовательности РНК, состоящие из нескольких нуклеотидов. Они способны регулировать экспрессию генов, но на посттрансляционном уровне, связываясь с мРНК и разрушая ее.
Нуклеотиды и их модификация
CpG - так обычно обозначаются цитозиновые (С) и гуаниновые (G) основания, которые находятся в цепочке ДНК, связанные между собой остатком фосфорной кислоты (p). Их еще могут обозначать как CpG-островки.
MpG - метилированный цитозин (см. рисунок). В статье на дальнейших модификациях метилцитозина делается особый акцент. Вернее, не столько на нем, сколько на необходимости различать метилированный и неметилированный цитозин.
Дезаминирование метилированных остатков цитозина – ферментативная реакция, которая превращает метилцитозин в урацил.
Методы в молекулярной биологии и биохимии
Бисульфитное аллель-специфичное секвенирование - метод секвенирования, который объединяет в себе два принципа: определение метилированных цитозинов и применение аллель-специфических праймеров. Секвенирование называется бисульфитным, потому что к смеси добавляют бисульфит натрия, который превращает неметилированные цитозины в урацилы, а метилированные цитозины остаются неизменными.
Преобразование Фурье - это математический инструмент, который позволяет разложить любой сложный сигнал на составляющие его простые сигналы. В контексте данной статьи преобразование Фурье упоминалось для обнаружения скрытых периодичностей в последовательности ДНК.
Метод выравнивания последовательностей используется для определения степени гомологии между молекулами ДНК, РНК или белков. Это позволяет установить, например, степень родства организмов между собой.
Амплификация - метод, позволяющий в экспериментальных условиях получить множество копий ДНК. Для этого молекулу ДНК сначала нагревают, она распадается на две цепочки. Добавляют праймер, ДНК-полимеразу и смесь дезоксирибонуклеотидов. Если праймер был подобран верно и он связался по принципу комплементарности с целевой последовательностью, то можно будет получить комплементарную копию ДНК. Для того, чтобы получить множество копий, данный цикл повторяют многократно.
Аффинная хроматография на основе домена MBD - метод выделения белков, способных метилироваться, с помощью метода аффинной хроматографии. Для этого используют неподвижную фазу в колонке, представленную метил-связывающим доменом (MBD). Смесь белков, часть из которых могут с данным доменом связаться, пропускают через колонку. Те из них, которые связываются с данным доменом, остаются на колонке, а остальные вымываются. Связавшиеся белки затем вымывают из колонок.
Ферменты
ДНКаза I – фермент, расщепляющий ДНК
Taq-полимераза – термостабильная ДНК-полимераза, которая играет ключевую роль в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Фермент был впервые выделен из термофильной бактерии Thermus aquaticus, которая обитает в горячих источниках
Hifi-полимераза – (от англ. high-fidelity — высокая точность) — это класс ДНК-полимераз, которые отличаются значительно более высокой точностью репликации ДНК по сравнению с обычной Taq-полимеразой.
Pfu-полимераза – в контексте этой статьи упоминается как полимераза, которая не способна продолжать синтез ДНК в присутствии урацила. Если говорить в целом, то эта полимераза меньше ошибается, обладает большей точностью.
Гены и геномы
Кластер HOXD – это группа генов, принадлежащих к семейству гомеобоксных генов (HOX), которые играют ключевую роль в формировании тела у животных в ходе эмбрионального развития.
Ген MEIS1 – (Myeloid Ecotropic Viral Integration Site 1) кодирует белок-транскрипционный фактор из семейства гомеобоксных белков TALE (Three Amino Acid Loop Extension), который участвует в регуляции развития, пролиферации и дифференцировки клеток.
Промотор – это особый участок ДНК, расположенный перед геном, который служит точкой инициации транскрипции. Промотор необходим для связывания РНК-полимеразы и вспомогательных белков (транскрипционных факторов), которые запускают считывание генетической информации с ДНК в молекулу РНК.
Мобильный генетический элемент LINE-1 – это автономный ретротранспозон, который является самым многочисленным мобильным элементом в геноме млекопитающих. В геноме человека он составляет около 17%. Большинство его копий неактивны, но небольшое количество так называемых «горячих» элементов всё ещё способно к ретротранспозиции. Может использоваться для того, чтобы регулировать экспрессию ближайших генов.
Частично метилированные домены (PMD) – это протяжённые участки генома с пониженным уровнем метилирования ДНК.
Ламинсвязанные структуры – это области хроматина, расположенные по периферии ядра и ассоциированные с ядерной ламиной — белковой сеткой, выстилающей внутреннюю ядерную мембрану.
«долины» метилированной ДНК (DMV) – это протяжённые области в геноме, характеризующиеся постоянно низким уровнем метилирования ДНК. В отличие от коротких CpG-островков в промоторах, DMV представляют собой более крупные гипометилированные регионы, которые встречаются как в геномах позвоночных, так и у растений.
метил-ДНК-связывающий домен (MBD) – это высококонсервативный белковый домен, который специфически распознает и связывается с метилированной ДНК, главным образом в CpG-динуклеотидах.
Метилирование бактериального генома – это добавление метильных групп к нуклеотидам ДНК с помощью ферментов ДНК-метилтрансфераз. В отличие от эукариот, где метилирование ДНК в основном происходит на цитозине в CpG-островках и служит для долговременной регуляции генов, у бактерий метилирование ДНК является основной формой эпигенетической регуляции и выполняет разнообразные функции, включая защиту от чужеродной ДНК и регуляцию жизненного цикла.
Линкерный участок (в контексте данной статьи) – это участок на молекуле ДНК, который связывает нуклеосомы между собой и который в большей степени подвергается деградации
Сайты связывания CTCF – это определённые последовательности ДНК, к которым присоединяется белок CTCF (фактор, связывающий последовательность CCCTC). CTCF — высококонсервативный белок, который играет ключевую роль в трёхмерной организации генома, регуляции экспрессии генов и поддержании стабильности хромосом.
Базы данных и библиотеки
NGS-библиотека – NGS - new generation sequencing (секвенирование нового поколения) позволяет определить нуклеотидную последовательность ДНК и РНК. В отличие от секвенирования по Сенгеру позволяет "прочитать" одновременно несколько участков генома. Создание NGS-библиотек позволяет стандартизировать подготовку проб для секвенирования генома.
База данных ENCODE (Encyclopedia Of DNA Elements) - база данных, в которой собрана информация о генах и регуляторных последовательностях ДНК человеческого генома.
Основная идея статьи
Основная мысль заключается в том, что современные методы анализа древней ДНК и ее метилирования позволяют ответить на вопросы, касающиеся особенностей развития и эволюции организмов (прежде всего человека).
Метод анализа метилирования древней ДНК основывается на использовании полимераз, которые способны распознать метилированные и неметилированные участки. Он позволяет определять картину метилирования древней ДНК, используя различные ДНК-полимеразы (например, Taq и Pfu).
Обнаружено, что у неандертальцев и денисовцев промоторы генов HOXD9, HOXD10 и MEIS1 (ключевых для развития конечностей) были метилированы, в отличие от современных людей. Это указывает на возможную эпигенетическую причину эволюционных изменений в строении конечностей.
Помимо метилирования, информацию об активности генов можно получить, анализируя карты нуклеосом (через периодичность в данных секвенирования) и участки, гиперчувствительные к ДНКазе I, что указывает на открытый хроматин и потенциальную активность гена.
Метилирование ДНК характерно для позвоночных в специфическом контексте (CpG), что позволяет с помощью аффинной хроматографии отделить древнюю ДНК млекопитающих от бактериальной, которая часто загрязняет образцы.
Комбинация методов анализа метилирования и структуры хроматина открывает путь к реконструкции активности генов у древних людей. Это может позволить найти эпигенетические различия, связанные с высшей нервной деятельностью, если будут найдены хорошо сохранившиеся образцы мозга.